p53 (acetyl K370) mAb

目录号：F2018

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生物描述

特异性

p53 (acetyl K370) Rabbit mAb可检测内源性p53 (acetyl K370)总的蛋白水平。
背景

转录因子p53通常被称为“基因组的守护者”，是基因毒性应激条件下细胞命运的关键调控器。在正常情况下，p53保持非活性状态，并通过E3泛素连接酶（如MDM2/HDM2、Pirh2、COP1和ARF-BP1）介导的持续降解维持在低水平。响应各种应激信号，p53 稳定性和转录活性得到增强，从而诱导大量下游靶基因。激活 p53 依赖性信号通路可导致多种细胞结果，包括生长停滞和细胞凋亡，具体取决于细胞类型和应激性质。p53 的乙酰化发生在其 C 末端调控域和/或 DNA 结合域内的多个赖氨酸残基上，该过程由组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 介导，例如 p300/CREB ​​结合蛋白 (CBP)、p300/CBP 相关因子和 Tip60。这种翻译后修饰通过增加 p53 的 DNA 结合亲和力并促进将 p300 等共激活因子募集到 p53 反应基因的启动子区域来增强 p53 的转录活性。 C 末端结构域中的特定赖氨酸残基（包括 K370、K372、K373、K381、K382 和 K386）被乙酰化，从而增强了 p53 的 DNA 结合能力并增强了其转录功能。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:100 1:500 1:200-1:400
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 43 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
Western Blotting
 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 90min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
 

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