P70 S6 Kinase beta/SRK-N-terminal Rabbit mAb

目录号:F2933

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生物描述

特异性

P70 S6 Kinase beta/SRK-N-terminal Rabbit mAb 用于检测内源性 P70 S6 Kinase beta 总的蛋白水平。

背景

p70 S6 激酶是一种丝裂原活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,对细胞生长和细胞周期 G1 期的进展至关重要。它磷酸化 40S 核糖体亚基的 S6 蛋白,在具有 5' 寡嘧啶束的 mRNA 的翻译调控中起关键作用。第二种同工型 p85 S6 激酶与 p70 S6 激酶来自同一基因,但在其 N 端包含额外的 23 个氨基酸,其中包含核定位信号。这两种同工型都在磷酸肌醇-3 激酶 (PI-3K) 和雷帕霉素敏感靶点 (FRAP/mTOR) 下游的丝裂原活化信号通路内运作。该通路与 Ras/MAP 激酶级联不同。p70 S6 激酶的活性受多种磷酸化事件调控在其催化、连接和伪底物结构域中。其中,催化结构域中 Thr229 和连接结构域中 Thr389 的磷酸化对其功能至关重要。p70 S6 激酶被认为是体内 40S 核糖体蛋白 S6 多位点磷酸化的主要激酶。通过中和抗体或用免疫抑制因子雷帕霉素治疗抑制 p70 S6 激酶和 p85 S6 激酶活性会显著削弱细胞通过细胞周期 G1 期的能力,强调其在细胞周期调控中的重要作用。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IHC IF FCM
1:10000 1:50 1:250 1:100
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 53 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件
(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 120 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭
1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:10000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤:
样品准备
1. 贴壁细胞:取洁净无菌盖玻片置于培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞:将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片:将玻片置于室温下解冻,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。
4. 石蜡切片:先将玻片脱蜡至水,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂,如 0.1~0.3% Triton X-100,室温通透 10~20 min。
(仅针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。)
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液,在室温下封闭至少 1 h。(常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。)
注意事项:从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润,避免干燥,否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色(第一天)
1. 吸走封闭液,滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色(第二天)
1. 吸走一抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI,室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次,每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片,将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HAP1
    Lane 2: HAP1 (KO RPS6KB2)
    Lane 3: HeLa
    Lane 4: Jurkat