Phospho-Akt (Thr450) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Akt (Thr450) Rabbit mAb 仅当Thr450 磷酸化时才可检测内源性总 Akt1 的蛋白水平。
背景	丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt，也被称为 PKB 或 Rac，是一种调控细胞存活和凋亡的关键蛋白激酶。它可经由 PI3K 依赖性途径被胰岛素和各种生长因子激活，且该途径可受到wortmannin 的抑制。Akt 的激活需要其与磷脂结合，随后由 PDK1 在活化环内的 Thr308 位点处进行磷酸化，以及在 C 末端的 Ser473 位点处进行磷酸化。Akt 通过磷酸化和失活关键靶标（包括 Bad、forkhead、c-Raf 和 caspase-9等）来抑制细胞凋亡，从而提高细胞存活率。PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号级联的主要负调控因子。除了促进细胞存活和糖原合成的作用外，Akt 还通过阻止 GSK-3β 介导的细胞周期蛋白 D1 (Cyclin D1 ) 的磷酸化和降解以及下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 p27 Kip1 和 p21 Waf1/Cip1 来调控细胞周期。在缺血性损伤反应中， Akt 可以被 JNK 重新激活，后者可磷酸化 Thr450，这是 PKD1 进一步磷酸化的关键启动步骤，以此介导后续 Akt 的活化。

特异性

Phospho-Akt (Thr450) Rabbit mAb 仅当Thr450 磷酸化时才可检测内源性总 Akt1 的蛋白水平。

背景

丝氨酸/苏氨酸激酶 Akt，也被称为 PKB 或 Rac，是一种调控细胞存活和凋亡的关键蛋白激酶。它可经由 PI3K 依赖性途径被胰岛素和各种生长因子激活，且该途径可受到wortmannin 的抑制。Akt 的激活需要其与磷脂结合，随后由 PDK1 在活化环内的 Thr308 位点处进行磷酸化，以及在 C 末端的 Ser473 位点处进行磷酸化。Akt 通过磷酸化和失活关键靶标（包括 Bad、forkhead、c-Raf 和 caspase-9等）来抑制细胞凋亡，从而提高细胞存活率。PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号级联的主要负调控因子。除了促进细胞存活和糖原合成的作用外，Akt 还通过阻止 GSK-3β 介导的细胞周期蛋白 D1 (Cyclin D1 ) 的磷酸化和降解以及下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 p27 Kip1 和 p21 Waf1/Cip1 来调控细胞周期。在缺血性损伤反应中， Akt 可以被 JNK 重新激活，后者可磷酸化 Thr450，这是 PKD1 进一步磷酸化的关键启动步骤，以此介导后续 Akt 的活化。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

60 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭（可选） 1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭（可选）

1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: LNCaP
Lane 2: LNCaP (serum-starved; Torin, 10.5 µM, 5h)
Lane 3: LNCaP (Torin, 10.5 µM, 5h)
Lane 4: LNCaP (Torin, 0.5 µM, 24h)