Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) Rabbit mAb

目录号：F0241

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生物描述

特异性

仅当 Thr288, Thr232 或 Thr198 位点分别发生磷酸化时，Phospho-Aurora A (Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198) Rabbit mAb 可检测内源性总 Phospho-Aurora A/B 的蛋白水平。
背景

Aurora 激酶是一种新型的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，在调控有丝分裂细胞分裂中起着关键作用。该家族由三个密切相关的成员组成：Aurora-A、Aurora-B 和 Aurora-C，它们是酵母 Ipll 和果蝇极光激酶的同源物，以参与着丝粒功能、双极纺锤体组装和染色体分离而闻名。所有三种哺乳动物 Aurora 激酶都具有高度保守的催化结构域，以及短的 C 端结构域和不同长度的 N 端结构域。Aurora-A 主要位于着丝粒、有丝分裂纺锤体微管和有丝分裂细胞的细胞质中。其蛋白质水平在细胞周期的 G1 和 S 期较低，但在 G2/M 期达到峰值。Aurora-A 催化域内 Thr288 位点的磷酸化可增强其激酶活性，这对于着丝粒分离、成熟以及纺锤体的组装和稳定性至关重要。Aurora-B 表达也在 G2/M 期达到峰值，其激酶活性从中期到有丝分裂结束时达到最高水平。在前期，Aurora-B 与染色体结合，然后在后期重新定位到纺锤体。它通过控制微管-着丝粒附着和胞质分裂来调控染色体分离。Aurora-A 和 Aurora-B 的表达在 G2/M 期转变期间与组蛋白 H3 的磷酸化紧密协调，对有丝分裂调控具有关键作用。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:1000 1:50 1:50
反应性 Human Mouse RatHuman, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 35, 40, 48 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa (hydroxyurea,4 mM,20hrs)
    Lane 2: HeLa (paclitaxel,100 nM,20hrs)