Phospho-c-Raf (Ser338) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	仅当 Ser338 位点发生磷酸化时，Phospho-c-Raf (Ser338) Rabbit mAb 可检测内源性总 Phospho-c-Raf (Ser338) 的蛋白水平。
背景	Raf 激酶家族包括 A-Raf、B-Raf 和 c-Raf (Raf-1)，是作为 Ras 下游效应子的关键丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调控细胞增殖、存活和肿瘤形成中发挥着重要作用。c-Raf 包含一个核心激酶结构域，负责磷酸化下游靶标（如 MEK），以及多个调控其活性的磷酸化位点。Ser338 处的磷酸化对于 c-Raf 激活至关重要；它可以响应有丝分裂信号而发生，也可以独立于 Ras 通过微管解聚后 Cdc42/Rac/Pak 激活而发生。Ser338 和 Tyr341 的磷酸化会破坏分子内相互作用以及 c-Raf 与 RKIP 的结合，从而促进其完全激活。这使得 c-Raf 能够通过 MAPK 通路传播信号，支持细胞生长和存活，并促进肿瘤形成。

特异性

仅当 Ser338 位点发生磷酸化时，Phospho-c-Raf (Ser338) Rabbit mAb 可检测内源性总 Phospho-c-Raf (Ser338) 的蛋白水平。

背景

Raf 激酶家族包括 A-Raf、B-Raf 和 c-Raf (Raf-1)，是作为 Ras 下游效应子的关键丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调控细胞增殖、存活和肿瘤形成中发挥着重要作用。c-Raf 包含一个核心激酶结构域，负责磷酸化下游靶标（如 MEK），以及多个调控其活性的磷酸化位点。Ser338 处的磷酸化对于 c-Raf 激活至关重要；它可以响应有丝分裂信号而发生，也可以独立于 Ras 通过微管解聚后 Cdc42/Rac/Pak 激活而发生。Ser338 和 Tyr341 的磷酸化会破坏分子内相互作用以及 c-Raf 与 RKIP 的结合，从而促进其完全激活。这使得 c-Raf 能够通过 MAPK 通路传播信号，支持细胞生长和存活，并促进肿瘤形成。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit

MW

74 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	Western Blotting 样品制备 1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。 2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。 3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。 4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。 5. 离心5分钟(使用微量离心机)。 6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。 7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min) 膜封闭与抗体孵育 a. 封闭 1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。 2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。 3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 b. 抗体孵育 1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。 2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。 4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 5. 进行检测。显影检测 1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。 2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。 3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

Western Blotting

样品制备

1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。

2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。

3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。

4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。

5. 离心5分钟(使用微量离心机)。

6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。

7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)

膜封闭与抗体孵育

a. 封闭

1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。

2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。

3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

b. 抗体孵育

1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。

2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。

4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

5. 进行检测。

显影检测

1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。

3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Zang M, et al. J Biol Chem. 2008 Nov 14;283(46):31429-37.

Application Data

IHC

Validated by Selleck

Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F0353 at 1/100 dilution.