Phospho-JAK1 (Tyr1034/1035)/JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody [L3G19] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-JAK1 (Tyr1034/1035)/JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody [L3G19] 仅识别 Tyr1007 和 Tyr1008 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平，Tyr1034 和 Tyr1035 处磷酸化的内源性 JAK1 蛋白水平。
背景	磷酸化JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化JAK2 (Tyr1007/1008) 代表Janus激酶JAK1和JAK2的活化形式，它们属于JAK家族，属于非受体酪氨酸激酶，介导细胞因子和生长因子受体信号转导。从结构上讲，JAK包含七个保守的Janus同源结构域 (JH1-JH7)：一个用于受体结合的N端FERM结构域、一个SH2样结构域、一个调节性假激酶结构域 (JH2) 和一个C端酪氨酸激酶结构域 (JH1)。它们与多种细胞因子受体的胞质尾部组成性相关，并普遍表达，其中 JAK1 广泛参与干扰素和 γc 家族细胞因子信号转导，JAK2 对促红细胞生成素、血小板生成素、GM-CSF 和其他造血细胞因子通路至关重要。它们的功能是磷酸化受体链和 STAT 转录因子，从而启动控制免疫、造血和发育的基因表达程序。JAK1 在 Tyr1034/1035 处的磷酸化和 JAK2 在 Tyr1007/1008 处的磷酸化发生在 JH1 激酶结构域的激活环内，是稳定激酶活性构象的关键事件。这些残基通过细胞因子诱导的受体二聚化和 JAK 分子间的转磷酸化进行磷酸化，从而减轻假激酶结构域的自身抑制。这种磷酸化是完全激活催化活性所必需的，从而能够有效磷酸化下游底物（受体、STAT 和 JAK 本身）。因此，磷酸化 JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化 JAK2 (Tyr1007/1008) 是开启 JAK-STAT 信号传导的关键分子开关，并被广泛用作通路激活的生物标志物。

特异性

Phospho-JAK1 (Tyr1034/1035)/JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody [L3G19] 仅识别 Tyr1007 和 Tyr1008 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平，Tyr1034 和 Tyr1035 处磷酸化的内源性 JAK1 蛋白水平。

背景

磷酸化JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化JAK2 (Tyr1007/1008) 代表Janus激酶JAK1和JAK2的活化形式，它们属于JAK家族，属于非受体酪氨酸激酶，介导细胞因子和生长因子受体信号转导。从结构上讲，JAK包含七个保守的Janus同源结构域 (JH1-JH7)：一个用于受体结合的N端FERM结构域、一个SH2样结构域、一个调节性假激酶结构域 (JH2) 和一个C端酪氨酸激酶结构域 (JH1)。它们与多种细胞因子受体的胞质尾部组成性相关，并普遍表达，其中 JAK1 广泛参与干扰素和 γc 家族细胞因子信号转导，JAK2 对促红细胞生成素、血小板生成素、GM-CSF 和其他造血细胞因子通路至关重要。它们的功能是磷酸化受体链和 STAT 转录因子，从而启动控制免疫、造血和发育的基因表达程序。JAK1 在 Tyr1034/1035 处的磷酸化和 JAK2 在 Tyr1007/1008 处的磷酸化发生在 JH1 激酶结构域的激活环内，是稳定激酶活性构象的关键事件。这些残基通过细胞因子诱导的受体二聚化和 JAK 分子间的转磷酸化进行磷酸化，从而减轻假激酶结构域的自身抑制。这种磷酸化是完全激活催化活性所必需的，从而能够有效磷酸化下游底物（受体、STAT 和 JAK 本身）。因此，磷酸化 JAK1 (Tyr1034/1035) 和磷酸化 JAK2 (Tyr1007/1008) 是开启 JAK-STAT 信号传导的关键分子开关，并被广泛用作通路激活的生物标志物。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

125 kDa, 130 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: U266, Lane 2: U266 (IFNα, 50ng/ml, 15 min)