Phospho-Jak2 (Tyr1007/1008) Antibody [L12G1] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Jak2 (Tyr1007/1008) Antibody [L12G1] 仅识别 Tyr1007/1008 处磷酸化的内源性 Jak2 蛋白水平。
背景	磷酸化Jak2 (Tyr1007/1008) 代表Janus激酶2 (Jak2) 中的关键激活环磷酸化位点。Jak2是Jak家族的非受体酪氨酸激酶，它与I类和II类细胞因子受体组成性结合，传递造血、免疫调节和生长信号。Jak2包含FERM、SH2和假激酶(JH2)结构域，这些结构域在配体诱导二聚化之前保持自身抑制状态。JH1激酶结构域中的Tyr1007/1008基序发生反式自身磷酸化，从而激活其催化活性。配体结合，例如促红细胞生成素与EPOR结合或干扰素-γ与IFNGR结合，可使受体聚集，解除JH2抑制，并启动Tyr1007/1008的顺序磷酸化，从而将Jak2活性放大100倍以上，募集STAT1/3/5等SH2结构域蛋白进行酪氨酸磷酸化、二聚化和核转位，进而驱动靶基因（包括SOCS反馈抑制因子、IRF1和BCL-XL）的转录。该信号通过受体结合位点，经由Jak2-STAT轴与PI3K-Akt和MAPK分支级联。同时，PTPN6/SHP1的负调控作用使环状结构去磷酸化，SOCS3与磷酸化的Tyr221结合，从而减弱信号传导持续时间。磷酸化酪氨酸1007/1008调控红系细胞成熟、Th1分化和巨核细胞发育，使其成为研究人员评估原代造血细胞培养中细胞因子通路完整性或解析CRISPR编辑细胞系中超敏反应的直接药效学标志物。V617F突变导致的失调会引起骨髓增生性肿瘤（如真性红细胞增多症）中的组成型激活。

特异性

Phospho-Jak2 (Tyr1007/1008) Antibody [L12G1] 仅识别 Tyr1007/1008 处磷酸化的内源性 Jak2 蛋白水平。

背景

磷酸化Jak2 (Tyr1007/1008) 代表Janus激酶2 (Jak2) 中的关键激活环磷酸化位点。Jak2是Jak家族的非受体酪氨酸激酶，它与I类和II类细胞因子受体组成性结合，传递造血、免疫调节和生长信号。Jak2包含FERM、SH2和假激酶(JH2)结构域，这些结构域在配体诱导二聚化之前保持自身抑制状态。JH1激酶结构域中的Tyr1007/1008基序发生反式自身磷酸化，从而激活其催化活性。配体结合，例如促红细胞生成素与EPOR结合或干扰素-γ与IFNGR结合，可使受体聚集，解除JH2抑制，并启动Tyr1007/1008的顺序磷酸化，从而将Jak2活性放大100倍以上，募集STAT1/3/5等SH2结构域蛋白进行酪氨酸磷酸化、二聚化和核转位，进而驱动靶基因（包括SOCS反馈抑制因子、IRF1和BCL-XL）的转录。该信号通过受体结合位点，经由Jak2-STAT轴与PI3K-Akt和MAPK分支级联。同时，PTPN6/SHP1的负调控作用使环状结构去磷酸化，SOCS3与磷酸化的Tyr221结合，从而减弱信号传导持续时间。磷酸化酪氨酸1007/1008调控红系细胞成熟、Th1分化和巨核细胞发育，使其成为研究人员评估原代造血细胞培养中细胞因子通路完整性或解析CRISPR编辑细胞系中超敏反应的直接药效学标志物。V617F突变导致的失调会引起骨髓增生性肿瘤（如真性红细胞增多症）中的组成型激活。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

130 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: UT-7, Lane 2: UT-7 (GM-CSF treated)