目录号:F1962

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生物描述

特异性

仅当 Ser22 磷酸化时 Phospho-Lamin A/C (Ser22) Rabbit mAb才 可检测内源性总 Phospho-Lamin A/C (Ser22) 的蛋白水平。

背景

磷酸化层蛋白 A/C (Ser22) 是层蛋白 A/C 的磷酸化形式,层蛋白 A/C 是一种 V 型中间丝蛋白,由 LMNA 基因编码,构成内核膜下方核层的一部分。层蛋白 A/C 为三部分结构,由非螺旋 N 端头部结构域(包含 Ser22)、中央 α 螺旋卷曲杆状结构域和 C 端免疫球蛋白样折叠组成。Ser22 处的磷酸化由激酶(例如 CDK1/细胞周期蛋白 B、PKC 和 CK2)介导,发生在特定细胞周期阶段和细胞环境中。这种修饰调控核稳定性、细胞周期进程和通过 LINC 复合物的信号传导。磷酸化 Ser22 层蛋白 A/C 还参与调控离子通道(如 Nav1.5),并可通过结合增强子结构域充当转录激活因子。 Ser22 磷酸化增加会增强 Lamin A 的移动性,从而可能破坏核纤层,如在哈钦森-吉尔福德早衰综合征 (HGPS) 等疾病中观察到的那样。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000 1:100
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit MW 69,78 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件
(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含PMSF),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜)。 PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 120 min。(电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭(可选)
1. 电转移后,室温下用 TBS 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa (Hydroxyurea, 4 mM, 20 hr)
    Lane 2: HeLa (Paclitaxel, 100 nM, 20 hr)
    Lane 3: NIH/3T3 (Hydroxyurea, 4 mM, 20 hr)
    Lane 4: NIH/3T3 (Paclitaxel, 100 nM, 20 hr)
    Lane 5: C6 (Hydroxyurea, 4 mM, 20 hr)
    Lane 6: C6 (Paclitaxel, 100 nM, 20 hr)