Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Mouse mAb

目录号：F0301

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生物描述

特异性

Phospho-Myosin Light Chain 2 (Ser19) Mouse mAb仅检测当丝氨酸19号位点 (Ser19)磷酸化时内源性平滑肌肌球蛋白轻链2(myosin Light Chain 2, MYL2/MLC-2)的水平。该抗体不与MYL2的心脏异构体发生交叉反应。
背景

Myosin regulatory light polypeptide 9由 MYL9 基因编码，是一种高度保守的蛋白质，在人类中普遍表达。在平滑肌组织中，它被称为肌球蛋白轻链 2 (MYL2/MLC-2)、肌球蛋白调节轻链 (MRLC)、RLC 或 LC20。 MLC2 在 Thr18 和 Ser19 两个位点被一种称为肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 的酶磷酸化，该过程依赖于钙和钙调蛋白的存在。MLC2 在 Ser19 处的磷酸化与肌球蛋白 ATPase 的活性密切相关，并有助于平滑肌的收缩。一旦在 Ser19 处被磷酸化，肌球蛋白 II 在与肌动蛋白相互作用时其 ATPase 活性会显著增加，从而导致其转变为丝状形式。这种激活对于产生细胞分裂和迁移等各种细胞功能所需的收缩力至关重要。因此，肌球蛋白轻链 2 在 Ser19 的磷酸化在调节细胞骨架的动力学和细胞的力学方面起着至关重要的作用，从而显著有助于在活细胞环境中对肌球蛋白 II的 组装和动力学控制。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
IF
1:200 - 1:400
反应性 Human, Mouse, Rat, Bovine, Pig
抗体类型 Mouse MW 18 KDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜(湿转法参考条件: 150mA 50min)。
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa (vehicle-treated)
    Lane 2: HeLa ( ML-7, 50μM, 15 min)