Phospho-PKC (Thr 514) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	当 Thr 514 位点磷酸化时 Phospho-PKC (Thr 514) Rabbit mAb 检测内源性 PKC (phospho T514) 总的蛋白水平。
背景	蛋白激酶 C (PKC) 是磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家族，对信号转导和细胞调控至关重要，包括生长、增殖、分化和凋亡。根据结构和生化特性，PKC 亚型分为经典 (cPKC)、新型 (nPKC) 和非典型 (aPKC) 组。PKC 结构由具有假底物序列的 N 端调控域、二酰甘油 (DAG) 结合 C1 域和结合 cPKC 中 Ca²⁺ 的 C2 域以及具有 ATP 和底物结合叶的 C 端催化域组成。Ca²⁺、DAG 和磷脂是负责激活 PKC 的辅助因子。 PKC 激活涉及三个关键位点的磷酸化：激活环、转角基序和疏水基序，其中激活环中苏氨酸 514 残基对于催化活性、稳定性和膜转位至关重要。这种磷酸化由 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 (PDK1) 介导，可调控 PKC 在信号转导中的作用，影响细胞周期调控和免疫应答等过程。失调的 PKC 活性与癌症、炎症和其他疾病有关，凸显了其作为治疗靶点和潜在生物标志物的重要性。

特异性

当 Thr 514 位点磷酸化时 Phospho-PKC (Thr 514) Rabbit mAb 检测内源性 PKC (phospho T514) 总的蛋白水平。

背景

蛋白激酶 C (PKC) 是磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家族，对信号转导和细胞调控至关重要，包括生长、增殖、分化和凋亡。根据结构和生化特性，PKC 亚型分为经典 (cPKC)、新型 (nPKC) 和非典型 (aPKC) 组。PKC 结构由具有假底物序列的 N 端调控域、二酰甘油 (DAG) 结合 C1 域和结合 cPKC 中 Ca²⁺ 的 C2 域以及具有 ATP 和底物结合叶的 C 端催化域组成。Ca²⁺、DAG 和磷脂是负责激活 PKC 的辅助因子。 PKC 激活涉及三个关键位点的磷酸化：激活环、转角基序和疏水基序，其中激活环中苏氨酸 514 残基对于催化活性、稳定性和膜转位至关重要。这种磷酸化由 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 (PDK1) 介导，可调控 PKC 在信号转导中的作用，影响细胞周期调控和免疫应答等过程。失调的 PKC 活性与癌症、炎症和其他疾病有关，凸显了其作为治疗靶点和潜在生物标志物的重要性。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC

稀释比例

WB	IP	IHC
1:1000	1:50	1:300

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

79 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa (PKC gamma peptide)
Lane 2: HeLa (PKC gamma non-phospho peptide)
Lane 3: HeLa
Lane 4: Mouse cerebellum
Lane 5: Mouse cerebellum (phosphatase treated)