Phospho-RSK2 (Ser227) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-RSK2 (Ser227) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 227 位点磷酸化时内源性 Phospho-RSK2 (Ser227) 总的蛋白水平。若在同源丝氨酸残基处磷酸化，它会与 RSK1 发生交叉反应。
背景	磷酸化 RSK2 (Ser227) 是指核糖体 S6 激酶 2 (RSK2) 在丝氨酸残基 227 处的磷酸化形式。核糖体蛋白 S6 激酶 2 (RSK2)，也称为 RPS6KA3，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可作为 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路的下游效应子。从结构上讲，RSK2 包含两个功能性激酶结构域：N 端激酶结构域 (NTKD) 和 C 端激酶结构域 (CTKD)，由调控连接结构域连接。 RSK2 广泛表达于脑、心脏和癌细胞等组织中，其活性受有丝分裂信号和病理条件的调控。磷酸化对于 RSK2 激活至关重要：ERK 磷酸化 CTKD 中的 Thr577，引发级联反应，导致 NTKD 中的 Ser227 由 PDPK1 磷酸化。这种磷酸化使 RSK2 能够与调控基因表达、细胞增殖和存活的底物相互作用。RSK2 磷酸化失调，尤其是 Ser227 处的失调与肿瘤发生有关，使其成为套细胞淋巴瘤 (MCL) 和多发性骨髓瘤 (MM) 等癌症的治疗靶点。

特异性

Phospho-RSK2 (Ser227) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 227 位点磷酸化时内源性 Phospho-RSK2 (Ser227) 总的蛋白水平。若在同源丝氨酸残基处磷酸化，它会与 RSK1 发生交叉反应。

背景

磷酸化 RSK2 (Ser227) 是指核糖体 S6 激酶 2 (RSK2) 在丝氨酸残基 227 处的磷酸化形式。核糖体蛋白 S6 激酶 2 (RSK2)，也称为 RPS6KA3，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可作为 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路的下游效应子。从结构上讲，RSK2 包含两个功能性激酶结构域：N 端激酶结构域 (NTKD) 和 C 端激酶结构域 (CTKD)，由调控连接结构域连接。 RSK2 广泛表达于脑、心脏和癌细胞等组织中，其活性受有丝分裂信号和病理条件的调控。磷酸化对于 RSK2 激活至关重要：ERK 磷酸化 CTKD 中的 Thr577，引发级联反应，导致 NTKD 中的 Ser227 由 PDPK1 磷酸化。这种磷酸化使 RSK2 能够与调控基因表达、细胞增殖和存活的底物相互作用。RSK2 磷酸化失调，尤其是 Ser227 处的失调与肿瘤发生有关，使其成为套细胞淋巴瘤 (MCL) 和多发性骨髓瘤 (MM) 等癌症的治疗靶点。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit

MW

90 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Matsumura-Kimoto Y, et al. Cancer Med. 2020 Jul;9(14):5185-5199.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Hela (λ-Phosphetase treated)
Hela (TPA/UV treated)
COS (λ-Phosphetase treated)
COS (TPA/UV treated)
NIH/3T3 (λ-Phosphetase treated)
NIH/3T3 (TPA/UV treated)