Phospho-Wee1 (Ser642) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	仅当 Wee1 Ser642 位点磷酸化时Phospho-Wee1 (Ser642) Rabbit mAb 才检测内源性 WEE1 总的蛋白水平。
背景	WEE1 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化抑制细胞周期依赖性激酶 (CDK)，对细胞周期调控至关重要，特别是在 G2-M 和 G1-S 检查点。它确保有丝分裂停滞并通过在 Y15 和 T14 处磷酸化 CDK1 来促进 DNA 修复，防止过早进入有丝分裂。WEE1 包含三个关键结构域：N 端调控结构域 (NRD)、中心激酶结构域 (KD) 和 C 端调控结构域 (CRD)。 WEE1 在 Ser642 位点被磷酸化，这是一个关键的调控事件，通过与 14-3-3 蛋白结合而稳定，从而保护其免于降解。AKT 在 Ser642 位点对 WEE1 的磷酸化促进了其核输出，而 CHK1 介导的磷酸化则在 DNA 损伤后激活 WEE1。此外，WEE1 磷酸化并调控 HSP90 和 SKP2 等蛋白质，影响分子伴侣活性和细胞周期抑制因子。WEE1 作为表观遗传修饰因子的作用及其对复制叉保护的影响凸显了其作为癌症治疗靶点的重要性。

特异性

仅当 Wee1 Ser642 位点磷酸化时Phospho-Wee1 (Ser642) Rabbit mAb 才检测内源性 WEE1 总的蛋白水平。

背景

WEE1 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化抑制细胞周期依赖性激酶 (CDK)，对细胞周期调控至关重要，特别是在 G2-M 和 G1-S 检查点。它确保有丝分裂停滞并通过在 Y15 和 T14 处磷酸化 CDK1 来促进 DNA 修复，防止过早进入有丝分裂。WEE1 包含三个关键结构域：N 端调控结构域 (NRD)、中心激酶结构域 (KD) 和 C 端调控结构域 (CRD)。 WEE1 在 Ser642 位点被磷酸化，这是一个关键的调控事件，通过与 14-3-3 蛋白结合而稳定，从而保护其免于降解。AKT 在 Ser642 位点对 WEE1 的磷酸化促进了其核输出，而 CHK1 介导的磷酸化则在 DNA 损伤后激活 WEE1。此外，WEE1 磷酸化并调控 HSP90 和 SKP2 等蛋白质，影响分子伴侣活性和细胞周期抑制因子。WEE1 作为表观遗传修饰因子的作用及其对复制叉保护的影响凸显了其作为癌症治疗靶点的重要性。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human

抗体类型

Rabbit

MW

95 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含PMSF, Phosphatase Inhibitor），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Alli VJ, et al. ACS Omega. 2023 Jun 2;8(23):20196-20233.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A431
Lane 2: A431 (EGF-treated)
Lane 3: H441
Lane 4: H441 (EGF-treated)