Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Rabbit mAb

目录号：F0556

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生物描述

特异性

仅当 Zap-70 Tyr319/Syk Tyr352 位点磷酸化时Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Rabbit mAb 才检测内源性 Phospho-Zap-70/Syk 总的蛋白水平。
背景

ZAP-70 是蛋白酪氨酸激酶 Syk 家族的成员，在 T 细胞和 NK 细胞中表达，在这些细胞中，它通过抗原受体结合在启动 T 细胞反应中起关键作用。这种细胞质激酶对于 T 细胞受体 (TCR) 激活引发的信号级联至关重要。从结构上讲，ZAP-70 由两个 SH2 结构域和一个羧基末端激酶结构域组成。在 TCR 刺激下，ZAP-70 内的几个酪氨酸残基被 Src 家族酪氨酸激酶 Lck 磷酸化。这些磷酸化事件对于 ZAP-70 的调控和活性以及其与其他信号分子的相互作用至关重要。酪氨酸残基 Y292、Y315 和 Y319 位于 ZAP-70 的域间 B 区域内。当这些残基被磷酸化时，它们被认为是下游信号分子的对接位点。值得注意的是，将 Y315 和 Y319 突变为苯丙氨酸会导致激酶活性丧失，这突显了它们在 ZAP-70 功能中的重要性。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:1000 1:200 - 1:800 1:200 - 1:800
反应性 Human, Mouse
抗体类型 Rabbit MW 70, 72 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Jurkat (hydrogen peroxide, 2mM, 2min)
    Lane 2: Jurkat (λ phosphatase treated)