PKCθ Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	PKCθ Rabbit mAb 可检测内源性 PKCθ 总的蛋白水平。
背景	PKCθ 是 Ca²⁺ 独立的新型 PKC (nPKC) 亚家族的成员，该亚家族还包括 PKCδ、PKCε 和 PKCη，主要在 T 细胞、肌肉细胞和血小板中表达。 PKC 家族分为三个亚家族：常规 PKC（cPKC；α、β 和 γ），需要 Ca²⁺ 和二酰甘油 (DAG) 才能激活；新型 PKC（nPKC；包括 PKCθ），不依赖 Ca²⁺；非典型 PKC（aPKC；λ 和 ι），不由 Ca²⁺ 或 DAG 激活。PKCθ 在 T 细胞活化中起关键作用，具有几个典型的 nPKC 亚家族保守功能域，包括 C2 样、假底物 (PS)、DAG 结合 (C1)、独特的 V3 区和激酶域。其 C2 样结构域含有酪氨酸残基 (Tyr-90)，该残基由 T 细胞酪氨酸激酶 Lck 磷酸化。 T 细胞还表达其他 PKC 家族成员，例如 cPKC（α 和 β）、nPKC（ε、η）和 aPKC（ζ）。然而，PKCθ 具有使其与众不同的特征，特别是它特定地位于 T 细胞的某些区域内。与其他 PKC 不同，PKCθ 独特地转移到抗原特异性 T 细胞和抗原呈递细胞 (APC) 之间的接触点（称为免疫突触 (IS)）的 T 细胞质膜上。T 细胞受体刺激后，PKCθ 被募集到 IS 对常规 T 细胞的激活和增殖至关重要。相反，PKCθ 会对调控性 T 细胞的抑制功能产生负面影响，因为它被排除在这些细胞的免疫突触之外。

特异性

PKCθ Rabbit mAb 可检测内源性 PKCθ 总的蛋白水平。

背景

PKCθ 是 Ca²⁺ 独立的新型 PKC (nPKC) 亚家族的成员，该亚家族还包括 PKCδ、PKCε 和 PKCη，主要在 T 细胞、肌肉细胞和血小板中表达。 PKC 家族分为三个亚家族：常规 PKC（cPKC；α、β 和 γ），需要 Ca²⁺ 和二酰甘油 (DAG) 才能激活；新型 PKC（nPKC；包括 PKCθ），不依赖 Ca²⁺；非典型 PKC（aPKC；λ 和 ι），不由 Ca²⁺ 或 DAG 激活。PKCθ 在 T 细胞活化中起关键作用，具有几个典型的 nPKC 亚家族保守功能域，包括 C2 样、假底物 (PS)、DAG 结合 (C1)、独特的 V3 区和激酶域。其 C2 样结构域含有酪氨酸残基 (Tyr-90)，该残基由 T 细胞酪氨酸激酶 Lck 磷酸化。 T 细胞还表达其他 PKC 家族成员，例如 cPKC（α 和 β）、nPKC（ε、η）和 aPKC（ζ）。然而，PKCθ 具有使其与众不同的特征，特别是它特定地位于 T 细胞的某些区域内。与其他 PKC 不同，PKCθ 独特地转移到抗原特异性 T 细胞和抗原呈递细胞 (APC) 之间的接触点（称为免疫突触 (IS)）的 T 细胞质膜上。T 细胞受体刺激后，PKCθ 被募集到 IS 对常规 T 细胞的激活和增殖至关重要。相反，PKCθ 会对调控性 T 细胞的抑制功能产生负面影响，因为它被排除在这些细胞的免疫突触之外。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF, FCM

稀释比例

WB	IP	IHC	IF	FCM
1:1000	1:100	1:50	1:200 - 1:800	1:200 - 1:800

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

78 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭（可选） 1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭（可选）

1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Hayashi K, et al. Pharmacol Res. 2007 Jun;55(6):537-44.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Jurkat
Lane 2: Raji
Lane 3: RL

IHC

Validated by Selleck

Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F0898 at 1/100 dilution.