Rab11A Antibody (Mouse mAb) [C20H15]

目录号：F3120

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生物描述

特异性

Rab11A Antibody (Mouse mAb) [C20H15] 可检测内源性 Rab11A 总蛋白水平。
背景

Rab11A是Rab家族中一种小型Ras相关GTP酶，作为循环内体运输和膜动力学的关键调控因子，通过控制受体、转运蛋白和黏附分子从内体区室返回质膜，并协调高尔基体后的胞吐作用，从而定义细胞膜的表面蛋白组。该蛋白具有典型的小GTP酶折叠结构，其核心为六链β折叠，周围环绕着α螺旋和高度保守的P环、开关I区和开关II区，这些区域能够结合并水解GTP。对Rab11亚型的结构研究表明，尽管Rab11a和Rab11b具有高度的序列同源性，但它们在开关II区的构象和GDP结合的寡聚状态上存在差异，这些特征可能调节它们与特定效应蛋白和细胞区室的相互作用。 Rab11 作为一种分子开关，在鸟嘌呤核苷酸交换因子（如 SH3BP5 和 GTP 酶激活蛋白）的调控下，于非活性 GDP 结合态和活性 GTP 结合态之间循环。它募集包括运动蛋白（肌球蛋白 Vb、驱动蛋白）、胞吐复合体系绳复合物和 Rab11 家族相互作用蛋白 (FIP) 在内的多种效应分子，构建运输机制，引导含有货物的循环内体从中心粒周围区室沿微管运输至特定的质膜区域。Rab11 定位于反式高尔基网络、高尔基后囊泡和循环内体，处于内吞和外吞途径的交汇点。它通过调控整合素、E-钙黏蛋白、转铁蛋白受体和 G 蛋白偶联受体的循环，协调细胞表面蛋白组成，从而影响细胞极性、连接组织、迁移和营养吸收。在胞质分裂过程中，Rab11阳性循环内体将膜蛋白和信号蛋白递送至胞质分裂沟和胞质分裂位点。Rab11的缺失或Rab11-FIP复合物的破坏会导致胞质分裂失败和胞质分裂中体异常分解，这表明Rab11介导的运输与细胞分裂的完成密切相关。在神经元中，Rab11与Rab5共同参与早期循环内体通路，调节神经营养受体（如BDNF结合的TrkB）的运输和信号输出；Rab5-Rab11信号内体支持局部树突信号传导、逆行轴突运输和核反应，该通路的功能障碍会损害BDNF信号传导，并参与神经退行性疾病的发生发展。 Rab11 也是宿主-病原体相互作用的中心节点，被细胞内病原体利用来重塑内体运输并创造复制微环境，其活性与癌症生物学有关，其中 Rab11 介导的运输改变会改变表面受体和粘附特征，从而影响增殖、侵袭和治疗反应。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB
1:1000-1:5000
反应性 Dog, Human, Mouse, Rat, Chicken
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 24 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Jurkat, Lane 2: MCF-7, Lane 3: Hela, Lane 4: SH-SY5Y