Raptor (H22E12) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Raptor (H22E12) Rabbit mAb 用于检测内源性 Raptor 总的蛋白水平。
背景	Raptor（mTOR 的调控相关蛋白）是一种关键的支架蛋白，在 mTOR（雷帕霉素的机制靶点）信号通路中起着至关重要的作用，该通路调控细胞生长、代谢和蛋白质合成。从结构上讲，Raptor 包含多个 WD40 重复序列，这些重复序列以促进蛋白质-蛋白质相互作用而闻名，特别是在其 C 端。这些重复序列使 Raptor 能够与 mTOR 和其他信号蛋白结合，形成 mTORC1（mTOR 复合物 1）的一部分。Raptor 对于激活 mTORC1 至关重要，因为它充当 mTOR 与其下游底物（如 4EBP1（真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1）和 p70S6K（S6 激酶））之间的桥梁。它将 mTOR 招募到 4EBP1，使 mTOR 的激酶活性能够磷酸化 4EBP1，进而释放eIF4E 是翻译起始的关键因子。该过程促进蛋白质合成，尤其是在营养丰富的条件下。它还与细胞信号（包括生长因子、氨基酸可用性和能量状态）整合，以调控 mTORC1 对细胞需求的反应。在包括秀丽隐杆线虫在内的各种生物体中，猛禽对于发育和生长必不可少，其消耗会导致发育停滞和代谢功能障碍等严重缺陷。

特异性

Raptor (H22E12) Rabbit mAb 用于检测内源性 Raptor 总的蛋白水平。

背景

Raptor（mTOR 的调控相关蛋白）是一种关键的支架蛋白，在 mTOR（雷帕霉素的机制靶点）信号通路中起着至关重要的作用，该通路调控细胞生长、代谢和蛋白质合成。从结构上讲，Raptor 包含多个 WD40 重复序列，这些重复序列以促进蛋白质-蛋白质相互作用而闻名，特别是在其 C 端。这些重复序列使 Raptor 能够与 mTOR 和其他信号蛋白结合，形成 mTORC1（mTOR 复合物 1）的一部分。Raptor 对于激活 mTORC1 至关重要，因为它充当 mTOR 与其下游底物（如 4EBP1（真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1）和 p70S6K（S6 激酶））之间的桥梁。它将 mTOR 招募到 4EBP1，使 mTOR 的激酶活性能够磷酸化 4EBP1，进而释放eIF4E 是翻译起始的关键因子。该过程促进蛋白质合成，尤其是在营养丰富的条件下。它还与细胞信号（包括生长因子、氨基酸可用性和能量状态）整合，以调控 mTORC1 对细胞需求的反应。在包括秀丽隐杆线虫在内的各种生物体中，猛禽对于发育和生长必不可少，其消耗会导致发育停滞和代谢功能障碍等严重缺陷。

使用信息

抗体应用

WB, IHC

稀释比例

WB	IHC
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

140 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Hara K, et al. Cell. 2002 Jul 26;110(2):177-89.

Application Data

WB

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Lane 1: 293
Lane 2: MCF-7
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