ROR2 Antibody (Rabbit mAb) [A21B16]

目录号：F7950

打印

生物描述

特异性

ROR2 Antibody (Rabbit mAb) [A21B16] 可检测内源性 ROR2 总蛋白水平。
背景

受体酪氨酸激酶样孤儿受体2 (ROR2) 是Ror家族的单次跨膜受体，其胞外包含免疫球蛋白样结构域、富含半胱氨酸的结构域和Kringle结构域，胞内包含酪氨酸激酶结构域。ROR2作为Wnt5a的受体或辅助受体，介导非经典Wnt信号通路。Wnt5a直接与ROR2的富含半胱氨酸的结构域结合，这种相互作用可以发生在受体复合物中。在该复合物中，ROR2通过其胞外区与Frizzled家族成员（如Frizzled2或Frizzled7）结合，形成Wnt5a反应单元，从而调节下游信号通路组分，包括Dishevelled。 Wnt5a刺激可诱导成骨细胞中ROR2同源二聚化和酪氨酸磷酸化，并增加支架蛋白14-3-3β的磷酸化，表明经典受体酪氨酸激酶级联反应被激活，该级联反应包括ROR2对底物的直接磷酸化，并促进成骨细胞分化和骨形成。遗传学研究表明，Ror2-/-和Wnt5a-/-小鼠均表现出发育缺陷，包括侏儒症、肢体和面部畸形、肺和生殖器发育不良以及室间隔缺损。此外，Wnt5a-ROR2信号通路抑制非洲爪蟾胚胎的趋同延伸运动，同时激活c-Jun N端激酶，表明ROR2位于Wnt5a依赖的非经典Wnt/JNK通路中，该通路调控形态发生细胞运动。在造血细胞K562中，Wnt5a可增加ROR2的表达，并诱导其内吞和与Wnt5a共定位。同时，ROR2与Wnt5a的结合会干扰Wnt5a与Frizzled4和LRP5的结合，从而使信号传导偏离β-catenin依赖的经典通路。在这些条件下，Wnt5a-ROR2信号通路调节β-catenin的酪氨酸磷酸化和核转位，并抑制β-catenin/TCF依赖的转录活性，同时下调细胞周期蛋白D1的表达。这揭示了Wnt5a/ROR2非经典轴抑制经典Wnt信号传导并在白血病模型中发挥抑癌作用的机制。ROR2/Fz受体复合物还通过调节Dishevelled的聚合来介导Wnt5a诱导的AP-1激活。 ROR2 通过其富含半胱氨酸的结构域与 Frizzled7 结合，该复合物促进 Wnt5a 触发的 Dishevelled 聚合，该聚合需要 DIX 和 DEP 结构域，聚合的 Dishevelled 与 Rac1 共定位，Rac1 的活性是 AP-1 启动子激活所必需的，从而勾勒出 Wnt5a–ROR2–Frizzled7–Dishevelled–Rac1–AP-1 信号轴。 ROR2 是一种 Wnt5a 结合受体酪氨酸激酶，它将细胞外 Wnt5a 梯度整合到涉及 JNK、Rac1 和 AP-1 的非经典信号输出中，同时调节 β-catenin 活性和细胞周期蛋白 D1 表达。它在骨骼形态发生、成骨细胞分化和经典 Wnt 信号调控中的作用，使其成为发育生物学和肿瘤环境中的重要靶点，因为 Wnt5a/ROR2 信号有助于细胞迁移、侵袭或抑制 β-catenin 驱动的转录。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 105 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa, Lane 2: HepG2