SQSTM1/p62 mAb Datasheet

生物描述

特异性	SQSTM1/p62 mAb 检测内源性 SQSTM1 / p62 总的蛋白水平。
背景	p62，也称为 SQSTM1，是一种多功能支架蛋白，通过参与自噬、蛋白质质量控制和应激反应，在维持细胞稳态中发挥关键作用。从结构上讲，p62 包含一个与泛素化蛋白质结合的泛素相关 (UBA) 结构域、一个促进 p62 募集到自噬体进行货物降解的 LC3 相互作用区 (LIR) 和一个通过 Nrf2 信号通路调控氧化应激的 Keap1 相互作用区 (KIR)。作为自噬的关键组成部分，p62 将泛素化底物连接到自噬机制，确保去除受损或错误折叠的蛋白质并维持蛋白质稳态。它还通过与 Parkin 和其他线粒体自噬相关蛋白相互作用，通过线粒体自噬调控线粒体健康。它还在激活NF-κB 通路是炎症、细胞存活和免疫应答的关键调控因子。它还充当氧化应激反应的衔接蛋白，稳定 Nrf2 并促进抗氧化基因的表达。p62 失调会导致神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）、癌症、代谢紊乱和与年龄相关的疾病的发展。

特异性

SQSTM1/p62 mAb 检测内源性 SQSTM1 / p62 总的蛋白水平。

背景

p62，也称为 SQSTM1，是一种多功能支架蛋白，通过参与自噬、蛋白质质量控制和应激反应，在维持细胞稳态中发挥关键作用。从结构上讲，p62 包含一个与泛素化蛋白质结合的泛素相关 (UBA) 结构域、一个促进 p62 募集到自噬体进行货物降解的 LC3 相互作用区 (LIR) 和一个通过 Nrf2 信号通路调控氧化应激的 Keap1 相互作用区 (KIR)。作为自噬的关键组成部分，p62 将泛素化底物连接到自噬机制，确保去除受损或错误折叠的蛋白质并维持蛋白质稳态。它还通过与 Parkin 和其他线粒体自噬相关蛋白相互作用，通过线粒体自噬调控线粒体健康。它还在激活NF-κB 通路是炎症、细胞存活和免疫应答的关键调控因子。它还充当氧化应激反应的衔接蛋白，稳定 Nrf2 并促进抗氧化基因的表达。p62 失调会导致神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）、癌症、代谢紊乱和与年龄相关的疾病的发展。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF, FCM

稀释比例

WB	IP	IHC	IF	FCM
1:1000	1:50	1:500	1:100	1:50 - 1:100

反应性

Human

抗体类型

Mouse

MW

62 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Kumar AV, et al. Front Cell Dev Biol. 2022 Feb 14;10:793328.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: U-2 OS
Lane 2: U-2 OS (KO SQSTM1)
Lane 3: HEK293T
Lane 4: HEK293T (KO SQSTM1)