XPD Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	XPD Rabbit mAb 用于检测内源性 XPD 总的蛋白水平。
背景	XPD（也称为 ERCC2）是一种重要的 ATP 依赖性解旋酶蛋白，在核苷酸切除修复 (NER) 途径中起着不可或缺的作用，该途径是通过修复 DNA 损伤（特别是由紫外线引起的损伤）来维持基因组稳定性的关键机制。它的特点是独特的 4Fe4S 簇，这对其解旋酶活性至关重要。XPD 属于解旋酶超家族 2 (SF2)，参与转录偶联 NER 和全球基因组 NER，促进损伤部位 DNA 双链的解旋。 XPD 的解旋酶功能通过其与 TFIIH 复合物的 N 端 p44 亚基的相互作用进行调控，而对于这种相互作用至关重要的 C 端域的突变会破坏 TFIIH 活性并损害 DNA 修复和转录。它还通过与 TFIIH 的细胞周期蛋白活化激酶 (CAK) 模块相互作用来调控细胞周期，从而影响有丝分裂。XPD 基因突变会导致着色性干皮病、毛发硫营养不良和科凯恩综合征，其特征是对紫外线辐射过敏、突变频率高、发育迟缓和癌症易感性增加。此外，XPD 中的单核苷酸多态性 (SNP)，特别是影响密码子 312 和 751 的单核苷酸多态性，与 DNA 修复能力改变和结直肠癌 (CRC) 易感性增加有关。

特异性

XPD Rabbit mAb 用于检测内源性 XPD 总的蛋白水平。

背景

XPD（也称为 ERCC2）是一种重要的 ATP 依赖性解旋酶蛋白，在核苷酸切除修复 (NER) 途径中起着不可或缺的作用，该途径是通过修复 DNA 损伤（特别是由紫外线引起的损伤）来维持基因组稳定性的关键机制。它的特点是独特的 4Fe4S 簇，这对其解旋酶活性至关重要。XPD 属于解旋酶超家族 2 (SF2)，参与转录偶联 NER 和全球基因组 NER，促进损伤部位 DNA 双链的解旋。 XPD 的解旋酶功能通过其与 TFIIH 复合物的 N 端 p44 亚基的相互作用进行调控，而对于这种相互作用至关重要的 C 端域的突变会破坏 TFIIH 活性并损害 DNA 修复和转录。它还通过与 TFIIH 的细胞周期蛋白活化激酶 (CAK) 模块相互作用来调控细胞周期，从而影响有丝分裂。XPD 基因突变会导致着色性干皮病、毛发硫营养不良和科凯恩综合征，其特征是对紫外线辐射过敏、突变频率高、发育迟缓和癌症易感性增加。此外，XPD 中的单核苷酸多态性 (SNP)，特别是影响密码子 312 和 751 的单核苷酸多态性，与 DNA 修复能力改变和结直肠癌 (CRC) 易感性增加有关。

使用信息

抗体应用

WB, IHC, IF

稀释比例

WB	IHC	IF
1:1000	1:50	1:250

反应性

Human

抗体类型

Rabbit

MW

87 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: K562
Lane 2: U87-MG
Lane 3: HeLa
Lane 4: A431
Lane 5: MCF7