YAP Rabbit mAb

目录号：F0366

打印

生物描述

特异性

YAP Rabbit mAb 可检测内源性总 YAP 的蛋白水平。
背景

Yes 相关蛋白 (YAP 或 YAP1) 是一种由位于人类 11q22 染色体上的 YAP 基因编码的癌蛋白。它是 Hippo 信号通路中的关键下游效应子，与转录辅激活因子 TAZ（具有 PDZ 结合基序的转录辅激活因子）协同作用。YAP 和 TAZ 在调控细胞增殖、再生、器官发育和干细胞自我更新方面发挥着关键作用，其活性受细胞外信号和细胞微环境的调控。YAP 还通过激活生存途径（如 survivin/杆状病毒 IAP 重复序列 5）来抑制细胞凋亡，从而促进细胞存活。YAP 包含 488 个氨基酸，包括几个结构域，特别是 TEA DNA 结合域和两个 WW 域。它的调控主要受 Hippo 信号通路控制。YAP/TAZ 复合物的抑制因子，大型肿瘤抑制因子 1 和 2 (LATS1 和 LATS2) 磷酸化 YAP，将其隔离在细胞质中并抑制其活性。YAP 的关键调控因子之一是 G 蛋白偶联受体 (GPCR)，它包含三个亚基：α、β 和 γ。特定的 GPCR 亚型，包括 Gα11、Gα12、Gα13、Gαi、Gαo 和 Gαq，可激活 YAP 和 TAZ，而 Gαs 可抑制它们。GPCR 激活 YAP 是通过 Rho GTPase 诱导的 F-肌动蛋白聚合发生的。LATS 激酶在特定位点（例如 Ser109 和 Ser127）进行磷酸化，导致 YAP 从细胞核易位到细胞质，在那里它与 14-3-3 蛋白相互作用。这些 LATS 介导的磷酸化事件也为 YAP 在相邻的磷酸化位点被 CK1δ/ε 进一步磷酸化做好准备，从而导致 YAP 的蛋白酶体降解。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM, ChIP 稀释比例
WB IP IHC IF FCM CHIP
1:1000 1:50 1:200 - 1:800 1:50 - 1:200 1:50 - 1:200 1:50
反应性 Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey
抗体类型 Rabbit MW 65-78 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB

Western Blotting

 
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
 
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
 
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
 
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
IHC

实验步骤：

 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
IF

实验步骤：

 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Urothelial Carcinoma tissue with F0366 at 1/100 dilution.