Akt1 Rabbit mAb

目录号: F0217

Lane 1: HeLA
Lane 2: NIH/3T3
Lane 3: C6

规格	价格	库存
20ul	790	现货
50uL	1240	现货
100ul	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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客户使用Selleck的Akt1 Rabbit mAb发表文献5篇

客户使用该产品的2个实验数据

操作要点

蛋白定位：细胞膜; 细胞质; 内膜; 线粒体; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:50

抗体应用
WB, IP

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
60 kDa

阳性对照	HeLa; NIH/3T3; C6; COS-7; MEF
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Akt1 Rabbit mAb 用于检测内源性 Akt1 总的蛋白水平。

Uniprot ID
P31749

克隆号
C19L11

背景
AKT 是许多细胞通路中的核心蛋白，在细胞存活、增殖、葡萄糖摄取、代谢、血管生成以及对辐射和药物的反应中发挥着至关重要的作用。 AKT 存在三种亚型：AKT1、AKT2 和 AKT3，每种亚型具有不同的生理功能、特性和表达模式，具体取决于细胞类型。 AKT1，也称为 v-akt 鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物 1，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它的激活是通过丝氨酸 473 和苏氨酸 308 的磷酸化来实现的。AKT1 主要负责磷酸化和定位 CKDN1A（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1，也称为 p21）。有趣的是，p21（一种通常存在于细胞核中的 CDK 抑制剂）经常被 AKT1 重新定位到细胞质。 p21 的这种由 AKT1 促进的细胞质定位在各种癌症中很常见，它通过抑制细胞凋亡所必需的蛋白质来促进肿瘤发生。在多种癌症类型中观察到不同 AKT 同工型的表达升高。具体来说，AKT1 水平升高与胃肠道间质瘤 (GIST)、甲状腺癌和乳腺癌有关，是预后不良的指标。

背景

AKT 是许多细胞通路中的核心蛋白，在细胞存活、增殖、葡萄糖摄取、代谢、血管生成以及对辐射和药物的反应中发挥着至关重要的作用。 AKT 存在三种亚型：AKT1、AKT2 和 AKT3，每种亚型具有不同的生理功能、特性和表达模式，具体取决于细胞类型。 AKT1，也称为 v-akt 鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物 1，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它的激活是通过丝氨酸 473 和苏氨酸 308 的磷酸化来实现的。AKT1 主要负责磷酸化和定位 CKDN1A（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1，也称为 p21）。有趣的是，p21（一种通常存在于细胞核中的 CDK 抑制剂）经常被 AKT1 重新定位到细胞质。 p21 的这种由 AKT1 促进的细胞质定位在各种癌症中很常见，它通过抑制细胞凋亡所必需的蛋白质来促进肿瘤发生。在多种癌症类型中观察到不同 AKT 同工型的表达升高。具体来说，AKT1 水平升高与胃肠道间质瘤 (GIST)、甲状腺癌和乳腺癌有关，是预后不良的指标。

参考文献
[1] de Renty C, et al. PLoS One. 2014 May 21;9(5):e97434. [2] Häggblad Sahlberg S, et al. Int J Oncol. 2017;50(1):5-14.

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%