Anti-Flag免疫磁珠

仅限科研使用

Anti-Flag免疫磁珠由高质量的重组鼠单抗与羟基磁珠共价偶联制备,具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量(至少为0.6mg protein/mL)以及非特异结合低的特点,可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质的纯化。

Anti-Flag免疫磁珠

产品优势

省时:比亲和凝胶法节省大约80min(以IP实验为例比较);

操作简单:磁性分离,无需离心;

非特异低:亲和凝胶孔径大,容易产生非特异吸附,而磁珠孔径小,不容易产生非特异吸附;

蛋白结合量高:与Sigma M2磁珠效果相当。

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价格对比

产品描述

Anti-Flag免疫磁珠由高质量的重组鼠单抗与羟基磁珠共价偶联制备,具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量(至少为0.6mg protein/mL)以及非特异结合低的特点,可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质的纯化。

产品性质

抗体亚型 重组鼠单抗
抗体纯化方法 Protein A 纯化制备
适用范围 免疫共沉淀(IP),蛋白纯化
推荐使用体积 蛋白质免疫共沉淀:200μl细胞裂解液使用20μL磁珠
融合蛋白结合容量 大于0.6mg protein/mL 磁珠
结合特性 甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白:Met-FLAG–Protein
N端Flag 融合蛋白:FLAG–Protein
C端 Flag 融合蛋白:Protein-FLAG
运输条件 蓝冰

储存条件(自收到货起)

可于2-8°C储存2年。避免冻融或离心磁珠。

实验方法

磁珠预处理
1、用移液枪轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠,转移20 μL磁珠悬液到新的离心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4),用移液枪轻柔吹打重悬磁珠,磁力架上静置1~2 min(也可适当延长至5min),去除上清,重复上述步骤两次。
注意:多个样品时,可磁珠预处理后再分装到各个反应管中。去除上清时,请用枪头轻轻吸取,吸力过大可能会导致部分磁珠损失。
样品的结合
3、在上述沉淀中加入200 μL细胞裂解液,用移液枪轻柔吹打重悬磁珠,然后室温孵 育2 h或者4 ℃条件下过夜。
4、磁力架上静置1-2 min(可适当延长)后,将上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测 Flag-tag蛋白是否存在残留)。
洗涤
5、向上述沉淀中加入500 μL PBST (NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM; Na2HPO4 8.1 mM; KH2PO4 1.76 mM; 0.5% Tween20),用手轻敲或轻柔地吹打重新分散磁珠,然 后上下翻转样品5 min。磁性分离后移除上清。
6、重复上述步骤两次。如遇到非特异性杂蛋白去除不干净的情况,请延长清洗时间、 增加清洗次数或适当增加清洗液中去垢剂的含量。
蛋白洗脱
根据下游用途选择不同的洗脱方法,进行免疫共沉淀可直接进行7-8步;进行蛋白纯化可根据后续实验,选择多肽竞争性洗脱(9-10步)或低pH洗脱(11-12步)。
变性洗脱(适用于利用anti-Flag beads进行免疫共沉淀实验):
7、对于直接检测目的蛋白的情况,在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液,煮沸5 min,冷却至室温并在磁力架上静置1-2 min(可适当延长)。
8、取上清进行SDS-PAGE检测。
Poly FLAG多肽竞争性洗脱(适用于利用anti-Flag beads进行蛋白纯化实验):
9、将含有200 μg-1 mg/mL Poly Flag多肽(B23111)的TBS缓冲液加入步骤6的产物中,Poly Flag多肽缓冲液体积为磁珠使用量的5倍,4℃摇床孵育洗脱2 h(为了提高洗脱效率,可延长孵育时间或重复洗脱)。
10、将上述步骤得到的产物进行磁性分离,将包含目的蛋白的上清转移到新的EP管中。磁珠如需重复使用,需用0.1 M glycine HCl (pH 3.0)进行清洗后再回收。
低pH洗脱(适用于利用anti-Flag beads进行蛋白纯化实验):
11、将0.1 M glycine HCl (pH 3.0)洗脱液加入步骤6中的产物中,洗脱液体积为磁珠使用量的5倍,摇床孵育洗脱5 min,洗脱时间不得超过20 min。
12、将上述产物进行磁力分离,取洗脱产物立即加入1 M Tris (pH 8.0)进行中和,并调节pH直至中性。

常见问题及解决方法

常见问题 可能原因 建议方法
高的背景条带 蛋白非特异结合到抗体,磁珠或EP管上 对裂解液进行预处理去除非特异蛋白;
在最后一次洗涤前, 转移整个样品到新的EP管中然后进行磁性分离。
洗涤次数不够 增加洗涤的时间和次数。
无蛋白条带 Flag标签蛋白没有表达 确保目的蛋白带有FLAG标签;
制备新鲜的裂解液;
使用恰当的蛋白酶抑制剂。
孵育时间不足 增加孵育时间。
样品中存在干扰物质 裂解液中存在高浓度的DTT,2-mercaptoethanol或者其他的还原剂;
过度的裂解液去污剂浓度干扰了抗原抗体的相互作用。

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