细胞核与细胞浆蛋白抽提试剂盒

1. 试剂准备
室温下融解试剂盒内的三种试剂，融解后立即置于冰上并混匀。取适量细胞浆蛋白抽提试剂A，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂使其成为终浓度为1 ×的溶液。细胞核蛋白抽提试剂同理备用。

2. 贴壁细胞处理
用PBS清洗一次，再用细胞刮刮取细胞或用EDTA溶液处理使细胞贴壁松动后用移液器吹打收集。离心所收集的细胞，尽量吸尽上清，保留细胞沉淀。避免使用胰酶，以防目的蛋白降解。

3. 悬浮细胞处理
用PBS清洗一次，离心收集细胞，尽量去除上清，保留细胞沉淀。

4. 细胞裂解
每10 cm培养皿的细胞沉淀加入200 μL含蛋白酶抑制剂的细胞浆蛋白抽提试剂A。（以每10 cm 培养皿 HeLa细胞为例，细胞沉淀体积约20 μL或40 mg。）

5. 涡旋混匀
最高速涡旋5 s，使细胞完全悬浮、分散。如未完全悬浮，可适当延长时间。

6. 冰浴
静置冰浴10~15 min。

7. 加入试剂B
加入10μL细胞浆蛋白抽提试剂B，最高速涡旋5 s，冰浴1 min。

8. 离心
最高速涡旋5 s后，在4℃、12,000-16,000g 条件下离心5 min。

9. 收集细胞浆蛋白
立即将上清转移至预冷的塑料管，其中即为细胞浆蛋白，可立即使用或-80 ℃冻存。注意吸取上清时尽量避免接触沉淀，可在其上方保留少量上清。（每10 cm 培养皿的细胞裂解后，所得细胞浆蛋白浓度约2~5mg/mL，具体视细胞类型而定。）

10. 细胞核蛋白提取
吸尽残余上清后，加入50 μL含蛋白酶抑制剂的细胞核蛋白抽提试剂C。注意务必吸尽残余上清，避免浆蛋白造成污染。

11. 涡旋与超声
最高速涡旋15-30 s，使沉淀完全悬浮、分散。将其转移至新的预冷PCR管中。超声破碎（20%功率，超声3 s，间隔1 s，循环3次）。注意确保探针位于液面下0.5 cm，避免液体溅出。

12. 细胞核蛋白离心
4℃、15,000g离心10 min。

13. 收集细胞核蛋白
立即将上清转移至预冷塑料管，其中即为细胞核蛋白，可立即使用或-80 ℃冻存。每皿细胞裂解后所得细胞核蛋白浓度约1.2~3.0 mg/mL，具体浓度因细胞类型而异。

14. 新鲜组织处理
a. 混合细胞浆蛋白抽提试剂A和B（20:1），并加入蛋白酶抑制剂至终浓度为1×，配成裂解工作液冰上备用。将组织尽可能切碎，按60 mg组织/200μL工作液的比例混合，并在冰浴或4℃下充分匀浆。
b. 转移匀浆液至新的预冷离心管，冰浴静置15 min。
c. 4℃、1,500g离心5 min，收集上清即为部分细胞浆蛋白提取物。注意吸取上清液时尽量避免触及沉淀。
d. 沉淀中仍包含大量未破碎的细胞，故继续按照步骤4~13进行细胞浆蛋白和细胞核蛋白提取。注意若组织初重为30~60 mg可直接按原步骤操作，若初重小于30 mg，后续步骤4-13中使用的溶液用量减半。之后第二次提取得到的细胞浆蛋白可与14-c. 步骤中所得浆蛋白合并。（新鲜肝组织裂解后细胞浆蛋白浓度约3~10 mg/mL，细胞核蛋白浓度3~10 mg/mL，具体浓度因组织状态而异。）