ALKBH5 Rabbit mAb
目录号: F1663
Filter:
-
Lane 1: NIH/3T3
Lane 2: Jurkat
Lane 3: Neuro-2a
Lane 4: HeLa
Lane 5: HepG2
操作要点
WB
蛋白定位
细胞核
建议使用 RIPA/核裂解液 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC-P |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 44 kda |
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC-P |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 44 kda |
| 阳性对照 | human testis; human kidney; HEK-293T; MEF; HeLa; HepG2; PC-12; NIH/3T3; Jurkat; Neuro-2a; F9 (PMID 21264265) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜 (湿转法参考条件: 150mA 90min)。
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。 |
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
ALKBH5 mAb检测内源性ALKBH5蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q6P6C2 |
| 克隆号 |
|---|
| K10A8 |
| 背景 |
|---|
ALKBH5 是 AlkB 双加氧酶家族的重要成员，它能够对各种 RNA 类型的 N6-甲基腺苷 (m6A) 修饰进行去甲基化，在 RNA 代谢和基因调控中发挥多种作用。它由 394 个氨基酸组成，具有保守的活性位点基序，这对于结合 Fe(II) 至关重要，有助于增强其酶活性。通过对关键 RNA 靶标上的 m6A 修饰进行去甲基化，ALKBH5 可增强 mRNA 稳定性和翻译，从而促进癌变相关途径，导致肿瘤形成。ALKBH5具有致癌和抑癌的双重活性。ALKBH5 表达降低会导致致瘤性增强、细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药性增强。它还通过调控固有和适应性免疫系统中的关键分子来影响免疫反应。这种调控作用会影响免疫细胞募集并介导肿瘤细胞的免疫逃逸，例如调节 PD-L1 表达和调控肿瘤微环境成分。ALKBH5还可作为胶质母细胞瘤 (GBM) 中预后重要生物标志物。 |
| 参考文献 |
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生物描述
| 特异性 |
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| Uniprot ID |
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| Q6P6C2 |
| 克隆号 |
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| K10A8 |
| 背景 |
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| 参考文献 |
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