APC Anti-Mouse CD40 (1C10) mAb

组织样本或细胞样本准备:
1.待检测的组织样本(如 脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等)用细胞染色缓冲液制成单细胞悬液。如果检测样本是体外刺激的细胞，将刺激后的细胞用细胞染色缓冲液重悬，然后进行第 2步；
2.用细胞染色缓冲液将总体积补充至~15 mL， 350g 离心5分钟，弃去上清液。
裂解红细胞:
3.需要裂解红细胞的组织(例如 脾脏)，用3mL红细胞裂解液重悬沉淀，冰上裂解5分钟；
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间；
4.加入 10 mL 细胞染色缓冲液终止裂解。350g 离心5分钟，弃去上清液；
5.重复步骤 2 的洗涤操作；
6.对活细胞进行计数，用细胞染色缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为 5-10x106 cells/ml，将细胞悬液以每管 100μl（每管含 5-10×10⁵个细胞）的量分装到 12×75mm 的流式管中。
封闭 Fc 受体:
封闭 Fc 受体有助于减少非特异性免疫荧光染色。
7.对于小鼠样品，我们建议使用对FcγR III/II具有特异性的 抗小鼠CD16/32抗体。在100μl 的体系中，每 10⁶个细胞加入 0.25μg 抗小鼠 CD16/32抗体，冰上预孵育 5-10 分钟；
8.对于人源样品，可在每 100μl 细胞悬液中加入 5μl 人Fc受体封闭液，室温孵育 5-10 分钟。若无有效/可用的封闭抗体，可用与免疫荧光染色所用抗体同种属、同型别的过量无关纯化Ig 封闭细胞。
使用抗体进行细胞表面染色:
9.按预先确定的最佳浓度加入荧光偶联抗体、生物素偶联抗体或纯化的一抗(例如抗CD3-FITC、抗CD4-Biotin和抗 CD8-APC)，冰上避光孵育 15-20 分钟；
10.用至少2mL细胞染色缓冲波洗涤2 次，以 350g 离心 5 分钟；
11.如果使用纯化的一抗，则将沉淀用残留缓冲液重悬，并加入预先确定的最佳浓度的抗种属免疫球蛋白荧光偶联二抗（例如 FITC 标记的抗小鼠Ig）， 冰上避光孵育 15-20 分钟；
12.重复步骤10；
13.用0.5mL细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并加入 5µl (0.25µg)/百万个细胞的 7-AAD 活力染色溶液排除死细胞；
注意避免光谱重叠。
14.冰上避光孵育 3-5 分钟；
15.进行荧光激活细胞分选(FACS)或流式细胞术分析。
注意:如果您无法立即上机检测，请将样品避光并置于4-8℃的冰箱中，样品应重悬于细胞染色缓冲液中。请注意，不要将样品长时间放置于固定缓冲液中，因为这会影响荧光基团构象和荧光强度。