ASK1 Rabbit mAb

目录号: F1172

    • Lane 1: Hela
    1/
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    操作要点

    WB
    蛋白定位
    细胞质; 内质网
    建议使用 RIPA/NP-40 裂解。

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:50 - 1:200
    1:200 - 1:400
    1:200 - 1:800
    抗体应用
    WB, IHC, IF, FC
    抗体类型
    Rabbit
    反应性
    Human, Mouse
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    155 kDa
    阳性对照 human lung carcinoma; HeLas; RAW 264.7s; HAP1; A549
    阴性对照

    实验方法

    WB
    Western Blotting
     
    样品制备
    1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
    2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
    3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
    4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
    5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
    6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
    7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜(湿转法参考条件: 200mA 150min)。
     
    膜封闭与抗体孵育
    a. 封闭
    1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
    2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
    3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
     
    b. 抗体孵育
    1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
    2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
    3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
    4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
    5. 进行检测。
     
    显影检测
    1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
    2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
    3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
    IF
    实验步骤:
     
    标本制备
    1. 吸出液体,然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
    注意:多聚甲醛有毒,只能在通风橱中使用。
    2. 室温固定细胞 15 分钟。
    3. 吸出固定液,用 1X PBS 冲洗 3 次,每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色。
     
    免疫染色
    1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
    2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
    3. 吸出封闭液,加入制备好的一抗稀释液。
    4. 4°C 孵育过夜。
    5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
    6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中,室温避光孵育 1-2 小时。
    7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次,每次 5 分钟。
    8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
    9. 为获得最佳效果,请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存,请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
     
    IHC
    实验步骤:
     
    脱蜡/补液
    1. 脱蜡/水合切片:
    2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次,每次 10 分钟。
    4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次,每次 10 分钟。
    5. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
    6.抗原修复:对于柠檬酸盐:将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中,在微波炉中加热,直至开始沸腾; 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
     
    染色
    1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
    3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
    4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
    5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
    6. 除去封闭液,并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
    7. 去除抗体溶液,用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
    8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
    9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次,每次 5 分钟。
    10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
    11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
    12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
    13. 如果需要,用苏木精复染切片。
    14. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
    15. 切片脱水:95%乙醇孵育切片两次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重复,孵育切片两次,每次 10 秒; 在二甲苯中重复,孵育切片两次,每次 10 秒。
    16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性

    ASK1 mAb检测内源性总ASK1蛋白水平。

    别名
    ASK 1
    Uniprot ID
    Q99683
    克隆号
    C15D9
    背景

    凋亡信号调节激酶 1 (Apoptosis signal-regulating kinase, ASK1) 属于丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 (MAP3K) 家族,可激活下游 MAP 激酶 (MAPK),特别是 c-Jun N 端激酶 (JNK) 和 p38 MAPK,以响应各种应激源,例如活性氧 (ROS)、内质网 (ER) 应激、脂多糖和钙超载。这些应激源激活 JNK 和 p38 通路会诱导细胞反应,包括程序性细胞死亡、分化和炎性细胞因子的产生。

    参考文献

    技术支持

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