ATM Rabbit mAb
目录号: F0216
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Lane 1: HeLa
Lane 2: NCCIT
Lane 3: PYS2
操作要点
WB
蛋白定位
细胞质; 胞质囊泡; 细胞骨架; 细胞核; 过氧化物酶体
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 350 kDa |
| 阳性对照 | HeLa; NCCIT; PYS2 |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤：
电泳分离
1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；
2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.电源200mA，100分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）
封闭(可选)
1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；
2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；
3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。
抗体孵育
1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；
3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；
4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
显色
1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；
2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
ATM Rabbit mAb 用于检测内源性 ATM 总的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13315 |
| 克隆号 |
|---|
| C20P15 |
| 背景 |
|---|
共济失调毛细血管扩张突变 (Ataxia-telangiectasia mutated, ATM) 激酶是 PI3K 相关激酶 (PIKK) 家族的成员，在 DNA 损伤反应 (DDR) 中至关重要，负责控制 DNA 双链断裂 (DSB) 的检测和修复。 与其他 PIKK 家族成员一样，ATM 是一种大蛋白 (350 kDa)，其激酶结构域与脂质激酶 PI3K 相似。 它被 DNA 末端束缚 MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) 复合物招募到 DNA DSB 位点，导致丝氨酸 1981 处的 ATM 自磷酸化。这种激活促使 ATM 二聚体解离，并随后导致丝氨酸 139 上附近组蛋白变体 H2AX 的磷酸化 (γH2AX)，在断裂位点启动 DDR 组件的组装，以促进 DNA 修复、细胞周期停滞和/或细胞死亡。 正常细胞过程、辐射或化学暴露引起的 DNA 断裂会带来致癌风险。 ATM 通过上调水平并通过自磷酸化激活来迅速响应 DNA 损伤。 然后它磷酸化底物，例如肿瘤抑制因子 p53、细胞周期激酶 ChK2 和 DNA 修复激酶。 ATM 中断细胞周期进程并促进 DNA 修复； 如果修复无法实现，就会引发细胞凋亡。 |
| 参考文献 |
|---|
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