β-Arrestin 2 Rabbit mAb
目录号: F0667
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Lane 1: Jurkat
Lane 2: COS
Lane 3: NIH3T3
Lane 4: C2C12
操作要点
WB
蛋白定位
细胞膜；包被小窝；细胞质；胞质囊泡；内膜；细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 50 kDa |
| 阳性对照 | Jurkat; COS; NIH3T3; Hela |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting 样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜(湿转法参考条件: 150mA 120min)。
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。 |
| IHC |
|---|
实验步骤： 脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。 |
生物描述
| 特异性 |
|---|
β-Arrestin 2 Rabbit mAb 可检测内源性 β-Arrestin 2 总的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P32121 |
| 克隆号 |
|---|
| P23M8 |
| 背景 |
|---|
抑制蛋白是一种多功能蛋白，在调控 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 脱敏、信号传导和内化方面发挥关键作用。抑制蛋白家族由四种亚型组成：视觉抑制蛋白 1、β-抑制蛋白 1、β-抑制蛋白 2 和视觉抑制蛋白 4。除了在 GPCR 信号传导中发挥作用外，β-抑制蛋白还充当支架和衔接蛋白，它们还可以与非 GPCR 受体相互作用。越来越多的证据表明，β-抑制蛋白与各种神经退行性疾病的发展有关，例如阿尔茨海默病 (AD)、额颞叶痴呆 (FTD) 和帕金森病 (PD)。在 AD 中，β-抑制蛋白直接与 γ-分泌酶相互作用，导致淀粉样蛋白-β 的产生和积累增加。在 FTD 中，β-arrestin 寡聚体抑制自噬货物受体 p62/SQSTM1，导致 tau 蛋白的积累和聚集。β-arrestin1 和 β-arrestin2 具有 78% 的序列相似性，具有重叠的功能，包括调控受体脱敏、内化和信号传导。这些蛋白质广泛表达于各种哺乳动物细胞类型和组织中，包括上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并且在大脑中尤其丰富。β-arrestin2 主要位于细胞质中，但在其 N 端包含一个核定位信号 (NLS)，这有助于核输入，以及一个 C 端核输出信号 (NES)，使其能够从细胞核中输出。这使得 β-arrestin2 能够在细胞质和细胞核之间穿梭。作为支架和衔接蛋白，β-抑制蛋白还在其他细胞过程中发挥关键作用，例如将 c-Src 家族蛋白募集到 GPCR 以参与 Erk 激活途径，并参与受体酪氨酸激酶的信号传导途径。此外，有证据表明 β-抑制蛋白可以转位到细胞核，在那里它们通过与转录辅因子相互作用来帮助调控基因转录。 |
| 参考文献 |
|---|
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