β-Catenin Rabbit mAb
目录号: F2521
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Lane 1: HeLa
Lane 2: MCF7
Lane 3: MCF7 (KO CTNNB1)
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-170 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, ChIP |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 85 kDa |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
53.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
β-Catenin Rabbit mAb 检测内源性 Beta Catenin 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| beta-Catenin,CTNNB1,β-Catenin |
| 克隆号 |
|---|
| M7A19 |
| 背景 |
|---|
β-catenin 是一种多功能蛋白，在黏附连接处和细胞内起着关键作用Wnt 信号通路。细胞中的大多数 β-catenin 位于黏附连接处，在那里它与钙黏蛋白的细胞质域结合。它还调控 α-catenin 的同源二聚化，从而影响肌动蛋白丝的分支和捆绑。在细胞质和细胞核中，β-catenin 是 Wnt 信号转导的核心。Wnt 蛋白是胚胎发育和干细胞维持等生物过程的关键调控因子，失调的 Wnt 信号与包括癌症在内的各种疾病有关。在没有 Wnt 信号的情况下，细胞浆 β-catenin 被 β-catenin 破坏复合物隔离和磷酸化，这标志着它进行泛素介导的蛋白酶体降解。在 Wnt 通路激活后，β-catenin 积累、转位到细胞核并与 Tcf/LEF 家族 DNA 结合蛋白结合，以驱动典型 Wnt 反应基因的转录。在黏附连接处，β-catenin 与 E-cadherin 和 α-catenin 相互作用，通过 α-catenin 同型二聚体促进与肌动蛋白丝的连接。当 Wnt 信号缺失时，β-catenin 与破坏复合物结合，在那里被 CK1α 和 GSK-3β 磷酸化。这种磷酸化触发 β-TrCP 泛素连接酶的泛素化和随后的蛋白酶体降解。在 Wnt 信号存在的情况下，β-catenin 逃避降解，在细胞核中积累，并与 Tcf/LEF 家族蛋白和其他转录因子形成复合物，激活 Wnt 靶基因表达。 |
| 参考文献 |
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