Btk Rabbit mAb
目录号: F0426
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Lane 1: Daudi
Lane 2: A20
Lane 3: Ramos
操作要点
WB
蛋白定位
细胞膜；细胞质；内膜；细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IHC, FCM |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 77 kDa |
| 阳性对照 | Ramos; OCI-AML3; Daudi; A20 |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。 |
| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Btk Rabbit mAb 可检测内源性总 Btk 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q06187 |
| 克隆号 |
|---|
| M4L24 |
| 背景 |
|---|
Bruton’s 酪氨酸激酶 (BTK) 是一种非受体酪氨酸激酶，在致癌信号传导中起关键作用，这一致癌信号对于各种 B 细胞恶性肿瘤如白血病中恶性细胞的增殖和存活至关重要。作为 TEC 非受体酪氨酸激酶家族的五个成员之一，BTK 与TEC 和 ITK 具有结构相似性，这三种蛋白质均含有五个不同的相互作用域：氨基末端普列克底物同源性 (PH) 域、富含脯氨酸的 TEC 同源性 (TH) 域、SRC 同源性域 SH2 和 SH3，以及负责酶活性的激酶域。BTK 主要位于细胞质中，并通过其 PH 域与磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 (PIP3) 的相互作用暂时募集到细胞膜上，而 PIP3 由磷脂酰肌醇-3 激酶 (PI3K) 产生。 BTK 激活发生在膜募集的两步过程中，在 B 细胞受体信号通路中起关键作用。这使得 BTK 对 B 细胞增殖、分化、发育和存活至关重要。失调的 B 细胞受体信号传导是 B 细胞恶性肿瘤的发病机制，这使得 BTK 成为B 细胞恶性肿瘤治疗的一个有力潜在靶点。 |
| 参考文献 |
|---|
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