Cleaved Caspase-3 (Asp175) Rabbit mAb
目录号: F0135
本抗体只识别Caspase-3剪切后的片段(17/19 kDa)，无法识别全链Caspase-3。
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Lane 1: Jurkat
Lane 2: Jurkat(Etoposide, 25 μM, 5 h)
操作要点
WB
蛋白定位
细胞质
建议使用 Tris-HCL 裂解。
易错提示
Fig.1 4T1细胞裂解液WB未看到条带 (细胞未经刺激)
本抗体识别Caspase-3在凋亡过程中因Asp175断裂产生的17 kda和19 kda两个蛋白片段，且该抗体不能识别全链Caspase-3蛋白。部分细胞系未经刺激处理时，两个蛋白片段表达水平较低，不能看到清晰条带。故建议制样过程中进行细胞刺激处理。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, FC |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 17, 19 kda |
| 阳性对照 | Mouse embryo; C6 (staurosporine, 1uM, 3h); NIH/3T3 (staurosporine, 1uM, 3h); Jurkat(etoposide, 25uM, 5h); HT-29 (staurosporine-treated) |
|---|---|
| 阴性对照 | HT-29 (untreated) |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 | ||||
| C6 | Staurosporine (1μM, 3 h) | ||||
| NIH/3T3 | Staurosporine (1μM, 3 h) | ||||
| Jurkat | Etoposide (25μM, 5 h) | ||||
| 点击查看更多样品数据 | |||||
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting 样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 50min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。 |
| IF |
|---|
实验步骤： 标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。 |
| IHC |
|---|
实验步骤： 脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。 |
生物描述
| 特异性 |
|---|
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Rabbit mAb可检测由内源性 Asp175 附近裂解产生的活化 caspase-3 大片段 (17/19 kDa) 的水平。 |
| 别名 |
|---|
| Active Caspase-3,Caspase 3,Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-3 (Asp175) |
| Uniprot ID |
|---|
| P42574 |
| 克隆号 |
|---|
| P20N20 |
| 背景 |
|---|
Caspase-3 是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族 (半胱氨酸蛋白酶) 的成员，主要因其在切割特定靶蛋白方面的作用而受到认识。它在细胞中广泛表达，有助于执行由外部和内部因素引发的细胞凋亡。除了细胞凋亡之外，Caspase-3 还调节多细胞生物中正常组织及癌组织的生长与维持。Caspase-3活化后，会切割各种下游底物，导致凋亡细胞发生特征性的形态变化。Caspase-3 的活化涉及其无活性酶原蛋白被水解加工成活性 p17 和 p12 片段，而随后被切割的底物需要在 P1 位存在天冬氨酸残基。 |
| 参考文献 |
|---|
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