Cleaved PARP (Asp 214) Rabbit mAb
目录号: F0136
客户使用Selleck的Cleaved PARP (Asp 214) Rabbit mAb发表文献4篇
客户使用该产品的1个实验数据
操作要点
WB
蛋白定位
染色体; 细胞质; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
易错提示
Fig.1 细胞裂解液WB出现杂带 (细胞未经刺激)
本抗体识别由Asp214断裂得到的Cleaved PARP蛋白，部分细胞系未经刺激处理时PARP全链蛋白不能被切割。如图所示，细胞未经刺激处理使得Cleaved PARP (Asp214)蛋白含量较低，一抗不能良好识别，继而导致二抗非特异性结合出现了杂带。故建议制样过程中进行样品刺激处理。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IHC, IF, F |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Monkey |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 89 kDa |
| 阳性对照 | Human tonsil; HeLa (Staurosporine, 1 μM, 3 h); Jurkat (etoposide, 25 μM, overnight); THP-1 (cycloheximide, 10 μg/ml, overnight) |
|---|---|
| 阴性对照 |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 | ||||
| HeLa | Staurosporine (1 μM, 3 h) | ||||
| Jurkat | Etoposide (25 μM, overnight) | ||||
| THP-1 | Cycloheximide (10 μg/mL, overnight) | ||||
| 点击查看更多样品数据 | |||||
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| IF |
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实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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| WB |
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实验步骤：
电泳分离
1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；
2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.电源200mA，120分钟。将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。推荐不要超过250mA，120分钟。）
封闭(可选)
1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；
2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；
3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。
抗体孵育
1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；
3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；
4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
显色
1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；
2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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Cleaved PARP (Asp214) Rabbit mAb 可检测内源性总 Cleaved PARP (Asp214) 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
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| P09874 |
| 克隆号 |
|---|
| M18N4 |
| 背景 |
|---|
PARP 是一种 116 kDa 核聚（ADP-核糖）聚合酶，在环境应激期间的 DNA 修复中发挥着关键作用。 随后显示，在药物诱导的各种细胞凋亡过程中，它被切割成 89 kDa 和 24 kDa 的片段。 这种切割破坏了酶响应 DNA 链断裂的能力，从而使其失活。 Caspase-3 是由 13 种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶组成的 caspase 家族的成员，主要负责细胞死亡过程中的 PARP 裂解。 caspase 3 切割 PARP (DEVD) 的序列在远缘物种中高度保守，表明 PARP 切割在细胞凋亡中的潜在重要性。 在人类中，PARP 在 Asp-214 和 Gly-215 之间被切割成两个 29 和 85 kDa 的片段，将 PARP 氨基末端 DNA 结合结构域 (24 kDa) 与羧基末端催化结构域 (89 kDa) 分开。 这个保守位点充当早期细胞凋亡标记。 虽然 PARP 的功能对于细胞活力至关重要，但它的裂解会促进细胞分解，标志着细胞正在凋亡。 |
| 参考文献 |
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