Eg5 Rabbit mAb
目录号: F0946
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Lane 1: A-431
Lane 2: MCF7
Lane 3: COLO 205
操作要点
蛋白定位：细胞质; 细胞骨架; 微管。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IF |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 120 kDa |
| 阳性对照 | A431; MCF-7; COLO 205; 293T |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| IF |
|---|
实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
|
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95–100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭（可选）
1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Eg5 Rabbit mAb 可检测内源性总 Eg5 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P52732 |
| 克隆号 |
|---|
| K11B11 |
| 背景 |
|---|
驱动蛋白-5 (Eg5)，又称为驱动蛋白超家簇成员11(KIF11），是一种正端定向的同源四聚体微管运动蛋白，对有丝分裂纺锤体动力学和细胞功能有重要作用。从结构上讲，Eg5 是一种具有双极结构的同源四聚体，使其能够交联和滑动反向平行微管，这对于有丝分裂期间双极纺锤体的形成至关重要。与结合与其运动域相反的“货物”的典型驱动蛋白不同，Eg5 的独特结构使其能够交联微管。在神经元中，Eg5 在有丝分裂后细胞中表达，并通过充当抑制因子来调控轴突生长；它的缺失会导致轴突延伸更长、更快。除了在有丝分裂中的作用外，Eg5 还在间期与核糖体结合，是高效蛋白质合成所必需的，它将核糖体与微管连接起来，并需要其 ATPase 活性才能进行正常翻译。由于 Eg5 在细胞分裂和蛋白质合成中起着关键作用，因此它是癌症治疗的潜在靶点，抑制其功能能破坏有丝分裂和细胞增殖。 |
| 参考文献 |
|---|
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