GLUT1为多次跨膜蛋白，故不建议对裂解后的样本进行高温煮样操作。
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Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F1192 at 1/100 dilution.
客户使用该产品的2个实验数据
WB
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操作要点
蛋白定位：细胞膜 (PMID:18245775)。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议一抗稀释比 1:10000-1:100000
请勿煮样，煮样易造成后续无法检测到条带、条带背景较深、位置不对或拖尾严重。
易错提示
Fig.1 细胞裂解液WB出现条带聚集 (样品进行了高温煮样)
本抗体识别GLUT1蛋白，GLUT1蛋白为葡萄糖转运蛋白，存在糖基化修饰，检测分子量约为40-60kDa（预测分子量为54kDa）。且GLUT1蛋白为多次跨膜蛋自，高温煮样操作易导致跑胶时发生条带聚集现象。故不建议制样过程中进行高温煮样操作。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC, IF, FCM |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 54 kDa |
| 阳性对照 | Human placenta; human fetal liver; Human colonic adenocarcinoma; Human cervical carcinoma; Human lung carcinoma; Mouse liver; Mouse brain; Human fetal brain; Human normal skin; Human normal breast; Human normal colon; Human kidney carcinoma; Human skeletal muscle; Human urinary bladder transitional carcinoma; HT-29; 3T3-L1; SW480; Jurkat; HeLa; HepG2; A549; Jurkat |
|---|---|
| 阴性对照 |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 |
| PDAC | Transfection (WDR79)(PMID：36712589) |
| HepG2 | DMSO (20 μM, 24 h) (PMID：36048765) |
| NCI-N87 | Ca2+(2 μM, 37 ℃, 10h)(PMID：38693181) |
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*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
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实验步骤：
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或 50~70 ℃ 煮样，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Glucose Transporter GLUT1 Rabbit mAb检测内源性葡萄糖转运体GLUT1总蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Glucose Transporter GLUT1,Glut1 |
| Uniprot ID |
|---|
| P11166 |
| 克隆号 |
|---|
| P22E15 |
| 背景 |
|---|
GLUTs，或促进扩散葡萄糖转运蛋白，是具有12个跨膜区域和细胞内氨基和羧基末端的膜蛋白。它们通过促进扩散机制促进葡萄糖在质膜上的转运。基于序列一致性和比对研究，GLUTs可分为I类、II类和III类。I类包括GLUT1至GLUT4, GLUT1主要在人β细胞中表达。在肝细胞中，GLUT1参与由甲状腺激素等激素调节的葡萄糖双向转运。 |
| 参考文献 |
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