HPRT Rabbit mAb

目录号: F2473

    抗体应用: 反应性:
    规格 价格 库存 购买数量
    20uL 790 现货
    50uL 1240 现货
    100uL 1990 现货
    100uL*2 3790 现货
     

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    操作要点

    蛋白定位:细胞质
    WB
    建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
    湿转参考条件:200 mA, 60 min
    建议一抗稀释比 1:10000-1:100000

    使用信息

    稀释比例
    1:10000
    1:10 - 1:100
    1:150
    抗体应用
    WB, IP, IHC
    反应性
    Human, Mouse, Rat
    抗体类型
    Rabbit
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    25 kDa

    实验方法

    WB
    实验步骤:
     
    样品制备
    1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),低温匀浆或置于冰上超声裂解样品,静置30 min。
    2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),超声破碎,冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
    6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
     
    转膜
    1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件:200 mA, 60 min
    (注意电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
     
    封闭
    1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
    2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
    3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:100000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
    2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
    3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
    4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
    2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性
    HPRT Rabbit mAb 用于检测内源性 HPRT 总的蛋白水平。
    克隆号
    F5D11
    背景
    HPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) 是由位于X染色体上的HPRT1基因编码的一个细胞维持酶,在嘌呤回收途径中发挥中心作用,通过转移磷酸核糖基团,从而将次黄嘌呤和鸟嘌呤分别转化为肌苷酸(IMP)和鸟苷酸(GMP)。从结构上看,HPRT是一个稳定的酶,由相同的亚单位组成一个同源四聚体,每个亚单位有不同的区域用于底物识别和催化,折叠方式以β-折叠和α-螺旋为主。虽然传统上被认为是一个广泛存在且低丰度的基因,HPRT1的表达在中枢神经系统中显著升高,并且在多种癌症中也表现为上调,并在侵袭性肿瘤中有异常定位。HPRT1曾主要用于作为评估癌症风险和环境暴露的突变生物标志物,但现在它作为癌症如乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌中的一个候选生物标志物和治疗靶点,正逐渐受到关注。
    参考文献

    技术支持

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