KEAP1 Rabbit mAb
目录号: F0484
操作要点
WB
蛋白定位
细胞质; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
|
| 抗体应用 |
|---|
| WB, IF |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 60-64 kDa |
| 阳性对照 | HEL; NK-92; OVCAR8; MCF; CTLL-2 |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting 样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 120min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤： 标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
KEAP1 Rabbit mAb 可检测内源性总 KEAP1 的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| KEAP1,P586 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q14145 |
| 克隆号 |
|---|
| L11G24 |
| 背景 |
|---|
核因子红系2 相关因子 2 (Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor, 2NRF2) 是一种转录激活因子，可与靶基因启动子区域中的抗氧化反应元件 (ARE) 结合，调控参与氧化应激反应的基因的表达。在正常情况下，NRF2 受到 KEAP1（也称为 INrf2）的抑制，后者与 NRF2 结合并将其保留在细胞质中，靶向进行泛素介导的降解。KEAP1-NRF2 通路是抵御氧化和亲电应激的主要防御机制。在体内平衡状态下，KEAP1 作为 E3 泛素连接酶复合物的一部分发挥作用，该复合物通过泛素化和随后的蛋白酶体降解严格控制 NRF2 活性。在受到应激时，KEAP1 内的传感器半胱氨酸会检测到应激信号，从而使 NRF2 逃逸泛素化，在细胞中积累并易位到细胞核中，在那里启动抗氧化基因的转录。 KEAP1-NRF2 通路的激活和细胞保护功能涉及四个相互关联的组成部分：(i) NRF2 的化学激活因子，(ii) KEAP1，作为这些激活因子的传感器，(iii) NRF2 本身，调控对氧化应激的转录反应，以及 (iv) 提供该通路保护作用的靶基因。KEAP1 包含多个应激传感器和失活机制，使其能够整合各种细胞信号，如氧化应激、细胞代谢物和受损的自噬，以调控 NRF2 活性。 |
| 参考文献 |
|---|
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