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Lane 1: C2C12
Lane 2: A431
Lane 3: T24
Lane 4: 293T
操作要点
蛋白定位：细胞质；细胞骨架。
WB
建议使用 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min，建议使用 0.22 μm PVDF膜。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
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| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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18 kda
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| 阳性对照 | C2C12; A431; T24 |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Myosin Light Chain 2 Rabbit mAb识别内源性的总Myosin Light Chain 2蛋白。 |
| 别名 |
|---|
| MYL9,Myosin Light Chain 2 |
| Uniprot ID |
|---|
| P24844 |
| 克隆号 |
|---|
| J14M12 |
| 背景 |
|---|
肌球蛋白由六条多肽链组成：两条相同的重链和两对轻链。肌球蛋白轻链 2 (MLC2)，也称为肌球蛋白调节轻链 (MRLC)、RLC 或 LC20，根据其分布有几种亚型。肌球蛋白轻链 2 (MYL2，也称为 MLC-2) 是一种 ∼19 kDa 肌节蛋白，属于 EF-手钙结合蛋白超家族，在哺乳动物横纹肌中以三种主要亚型存在，由三种不同的基因编码。这些亚型是：MLC-2f（快肌收缩骨骼亚型）、MLC-2v（心室和慢肌收缩骨骼亚型）和 MLC-2a（心房亚型），每种亚型在哺乳动物中都有独特的发育表达模式。在平滑肌中，MLC2 在 Thr18 和 Ser19 位点被肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) 以 Ca2+/钙调蛋白依赖性方式磷酸化，这与肌球蛋白 ATPase 活性和平滑肌收缩有关。 |
| 参考文献 |
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