Nanog (H17H16) Rabbit mAb
目录号: F2873
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: NCCIT
操作要点
蛋白定位：细胞核。
WB
建议使用 RIPA/Nuclear Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比 1:10000。
WB
建议使用 RIPA/Nuclear Lysis Buffer 制备裂解物。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
建议一抗稀释比 1:10000。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, FCM |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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34 kDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| Nanog (H17H16) Rabbit mAb 用于检测内源性 Nanog 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| H17H16 |
| 背景 |
|---|
| NANOG是一个关键的转录因子，对于维持胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的多能性和自我更新至关重要。它包含一个用于DNA结合的同源结构域，一个用于基因调控的转激活结构域，以及一个参与蛋白质间相互作用的C端结构域。NANOG在早期胚胎发育中发挥着关键作用，通过通过OCT4和SOX2等调控网络防止分化并维持多能状态。它通过调节染色质的可及性和激活自我更新所需的基因来影响细胞命运。NANOG与Wnt/β-连环蛋白通路相互作用，调节多能性。NANOG可以调节β-连环蛋白的磷酸化，影响其活性，并控制干细胞中自我更新和分化之间的平衡。这种相互作用对于维持干细胞的身份和功能至关重要。NANOG的异常激活促进癌症干细胞（CSC）特性，如自我更新、上皮-间质转化（EMT）、转移和耐药性。其致癌潜力依赖于Wnt/β-连环蛋白、STAT3和SOX2等通路的协同作用，而不是独立发挥作用。NANOG通过与基因启动子结合并与染色质重塑因子相互作用，影响干性和存活通路。 |
| 参考文献 |
|---|
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