NEDD4 Rabbit mAb
目录号: F1464
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: COS-7
Lane 2: MCF-7
Lane 3: 293
操作要点
蛋白定位：细胞膜, 细胞质, 内膜系统, 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议 SDS-PAGE 分离胶浓度：5%。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
|
|---|
|
115 KDa
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使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Monkey |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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|---|
|
115 KDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| 克隆号 |
|---|
| J3A7 |
| 背景 |
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| 参考文献 |
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| NEDD4 Rabbit mAb 用于检测内源性 NEDD4 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| J3A7 |
| 背景 |
|---|
| NEDD4（神经前体细胞表达，发育下调4）是HECT（与E6AP羧基末端同源）E3泛素连接酶家族的关键成员，参与调节蛋白降解、信号转导和内吞作用。它的结构包括用于膜结合的N端C2结构域、催化泛素转移的中央HECT结构域以及多个WW结构域，这些WW结构域识别底物上的富含脯氨酸的基序（PPxY）或磷酸化残基。NEDD4通过将多泛素链附着到目标蛋白上，标记它们进行蛋白酶体或溶酶体降解。NEDD4调节的底物包括离子通道、转运蛋白和受体，如ENaC、Gap1p和Ste2p，这些底物通过内吞作用进行下调。NEDD4的活性受激酶（如SGK1）的磷酸化调节，磷酸化使其与底物的相互作用得到调节。NEDD4家族成员，包括Smurf1和Smurf2，通过泛素化特定Smads来调节TGF-β信号通路，影响细胞生长、分化和凋亡。NEDD4在调节如自噬、癌症进展和免疫反应等路径中的作用，突显了它在细胞稳态中的重要性。NEDD4的失调，包括过度表达或突变，会导致癌症和神经退行性疾病。 |
| 参考文献 |
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