Non-phospho 4E-BP1 (Thr 46) Rabbit mAb
目录号: F0585
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Lane 1: COS (λ phosphatase treated)
Lane 2: COS (FBS treated)
操作要点
WB
蛋白定位
细胞质; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IF, FCM |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 15-20 kDa |
| 阳性对照 | COS (λ phosphatase treated); 293 (serum starved; U0126,10 μM, 2 h; LY294002, 50 μM, 2 h; Rapamycin, 10 nM, 2 h); 293 (serum starved; l phosphatase, 10000 U/mL, 2 h); HEK-293 (Insulin, 100 nM, 30 min); HEK-293 (U0126, 10 µm, 2 h; LY294002,50 µM, 2 h; Rapamycin, 10 µM, 2 h); HEK-293 (Insulin, 100 nM, 30 min; λ phosphatase treated) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 50min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤： 标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特异性 |
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Non-phospho 4E-BP1 (Thr 46) Rabbit mAb 可检测当 Thr 46位点去磷酸化时 4E-BP1 内源性总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| PHAS-I, EIF4EBP1 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q13542 , Q13541 , O60516 |
| 克隆号 |
|---|
| L9H10 |
| 背景 |
|---|
真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1 (4E-BP1) 是翻译抑制因子家族的成员，也是雷帕霉素 (mTOR) 信号通路机制靶点的关键底物。当 4E-BP1 被磷酸化时，它会释放 eIF4E，从而允许依赖于帽子的翻译进行。磷酸化的 4E-BP1 被广泛认为是活跃的 mTOR 信号传导的指标。4E-BP1 上有七个已知的磷酸化位点：Thr37、Thr46、Ser65、Thr70、Ser83、Ser101 和 Ser112。其中前五个位点在物种间是保守的，Thr37 和 Thr46 位点的磷酸化是初始启动步骤，随后是 Thr70 位点的磷酸化，最后是 Ser65 位点的磷酸化。4E-BP1 的过度磷酸化会破坏其与 eIF4E 的相互作用，从而激活帽子依赖性翻译。4E-BP1 的活性受 PI3K/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶的调控。 |
| 参考文献 |
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