PABP1 Rabbit mAb

目录号: F1648

  • Lane 1: HeLa
    Lane 2: C2C12
    Lane 3: RAW 264.7
    Lane 4: PC-12
规格 价格 库存 购买数量
20uL 790 现货
50uL 1240 现货
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客户使用该产品的1个实验数据

IF

操作要点

蛋白定位:细胞突起; 细胞质; 细胞核; 剪切小体
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。

使用信息

稀释比例
1:1000
1:30
1:100
1:500
抗体应用
WB, IP, IF, FCM
抗体类型
Rabbit
反应性
Human, Mouse, Rat
储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
预测分子量
71 kDa
阳性对照 HeLa; PC-3; LNCaP; C2C12; NIH/3T3; RAW 264.7; PC-12
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤:
 
样品制备
1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
 
转膜
1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件:200 mA, 120 min
(注意电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
 
封闭
1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:1000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤:
样品准备
1. 贴壁细胞:取洁净无菌盖玻片置于培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞:将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片:将玻片置于室温下解冻,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。
4. 石蜡切片:先将玻片脱蜡至水,纯水或 PBS 摇洗 3次,每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂,如 0.1~0.3% Triton X-100,室温通透 10~20 min。
(仅针对胞内抗原,若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。)
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次,每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液,在室温下封闭至少 1 h。(常用的封闭液包括:与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。)
注意事项:从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润,避免干燥,否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色(第一天)
1. 吸走封闭液,滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色(第二天)
1. 吸走一抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗,PBST 摇洗 3 次,每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI,室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次,每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片,将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性

PABP1 Rabbit mAb 可检测内源性 PABP1 总的蛋白水平。

别名
PABP, PABP1
Uniprot ID
P11940
克隆号
H6J19
背景

多聚腺苷酸结合蛋白 (PABP) 是真核生物中发现的一种关键且高度保守的 mRNA 相互作用蛋白,在人类中已鉴定出 7 种亚型,其中最丰富的是细胞质 PABPC1。作为 mRNA-蛋白质复合物的关键组成部分,PABP 与 mRNA 的多聚腺苷酸尾结合并与翻译起始因子 4G 和真核释放因子 3a (eRF3a) 相互作用。它在刺激翻译起始和抑制无义介导的 mRNA 衰变 (NMD) 方面发挥着重要作用。PABP 在翻译终止中的作用与其 C 端结构域及其与 eRF3a 的 N 端相互作用有关。它通过将 eRF3a 和 eRF1 募集到核糖体、促进 eRF1-eRF3 复合物的结合以及改善终止密码子识别来提高翻译终止的效率。此外,PABP 保护 poly(A) 尾免受核酸酶降解,并与 5′ 非翻译区 (5′UTR) 中的 poly(A) 片段结合,影响翻译起始。PABP 在翻译终止中的作用包括优化 eRF3a 在核糖体上的定位,以增强对终止密码子的识别并催化肽基-tRNA 水解。

参考文献

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