Phospho-Akt1 (Ser 129) Rabbit mAb
目录号: F2636
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MCF7
Lane 2: MCF7 (λ phosphatase-treated)
操作要点
蛋白定位：细胞膜, 细胞质, 内膜系统, 线粒体, 细胞核。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
|---|
| WB |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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60 KDa
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实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
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生物描述
| 特异性 |
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| Phospho-Akt1 (Ser 129) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 129 位点磷酸化时内源性 Akt1 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
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| AKT1 (phospho S129),Phospho-Akt1 (Ser129) |
| 克隆号 |
|---|
| N19C7 |
| 背景 |
|---|
| Akt1，也称为蛋白激酶B（PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节代谢、细胞存活、增长和增殖中起着至关重要的作用。它是PI3K/Akt信号通路的核心组成部分，该通路在癌症和其他疾病中经常发生失调。Akt1包含三个主要结构域：N端的pleckstrin同源（PH）结构域、中心的激酶结构域和C端的调节结构域。PH结构域结合磷脂酰肌醇（PIP3或PI(3,4)P2）在质膜上，通过PDK1在Thr308位点的磷酸化和mTORC2在Ser473位点的磷酸化促进Akt激活。此外，CK2在Ser129位点的磷酸化通过稳定Akt的活性构象并防止Thr308去磷酸化（通过HSP90的结合）来增强Akt活性。这种磷酸化使Akt处于超激活状态，影响下游通路，如细胞存活、抗凋亡和β-连环蛋白依赖的转录活性。Akt的激活受到脂质结合和磷酸化事件的严格调控，这些事件控制其催化活性。Akt1的失调会导致癌症进展、代谢紊乱和凋亡。 |
| 参考文献 |
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