抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: MEF (KD Akt1), Lane 2: MEF (KD Akt1; hPDGF-AA, 100 ng/ml, 15 min), Lane 3: MEF (KD Akt2), Lane 4: MEF (KD Akt2; hPDGF-AA, 100 ng/ml, 15 min)
客户使用该产品的实验数据
WB
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IP |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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60 kDa
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| 阳性对照 | Jurkat (Calyculin A treated); MEF (hPDGF-AA, 100 ng/ml, 15 min); LNCaP (transfected with Akt1 shRNA) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
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仅当 Akt2 Ser474 位点磷酸化时Phospho-Akt2 (Ser474) Rabbit mAb 才检测内源性 Phospho-Akt2 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| AKT2 (phospho S474),Phospho-Akt2 (Ser474) |
| Uniprot ID |
|---|
| P31751 |
| 克隆号 |
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| L16H11 |
| 背景 |
|---|
Akt 也称为蛋白激酶 B (PKB)，属于 AGC 激酶家族，该家族包括其他激酶，例如 S6K、RSK、SGK 和 PKC。包括 Akt 在内的该家族的一个共同特征是在两个关键位点进行磷酸化：催化位点（活化环或 T 环）和 C 端疏水基序 (HM) 位点。Akt2 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，属于 Akt/PKB 原癌基因家族。Akt1 和 Akt2 均作为磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI 3-激酶) 下游的信号转导子。尽管 Akt1 和 Akt2 由不同的基因编码，但它们的羧基末端区域的变化最大。Akt1 在调控糖原代谢以及细胞生长和存活方面起着关键作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通过两种复合物影响细胞生长和增殖：raptor-mTOR (TORC1) 和 rictor-mTOR (TORC2)。TORC2 已被确定为难以捉摸的 PDK2，负责疏水基序中 Ser473 处的 Akt/PKB 磷酸化。这种磷酸化与活化环中的 Thr308 共同，对于 Akt 的正常运作至关重要。 |
| 参考文献 |
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