Phospho-EGF Receptor (Thr669) Rabbit mAb

目录号: F1394

Lane 1: A-431
Lane 2: A-431 (EGF,100 ng/ml,15 min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
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使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:200

抗体应用
WB, IP

抗体类型
Rabbit

反应性
Human

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
175 kDa

实验方法

WB
Western Blotting 样品制备 1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。 2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。 3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。 4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。 5. 离心5分钟(使用微量离心机)。 6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。 7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 70min) 膜封闭与抗体孵育 a. 封闭 1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。 2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。 3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 b. 抗体孵育 1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。 2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。 4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 5. 进行检测。显影检测 1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。 2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。 3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Western Blotting

样品制备

1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。

2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。

3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。

4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。

5. 离心5分钟(使用微量离心机)。

6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。

7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 70min)

膜封闭与抗体孵育

a. 封闭

1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。

2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。

3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

b. 抗体孵育

1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。

2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。

4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

5. 进行检测。

显影检测

1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。

3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
仅当 Thr669 磷酸化时 Phospho-EGF Receptor (Thr669) Rabbit mAb 才可检测内源性总 Phospho-EGF Receptor (Thr669) 的蛋白水平。

克隆号
H18D23

背景
表皮生长因子受体 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 是一种 170 kDa 跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶 (RTK) ErbB 家族的成员，该家族包括 EGFR、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4。这些受体触发细胞内信号通路，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt 通路，这些通路可调控细胞增殖、分化和凋亡。EGFR 在 Thr669 处的磷酸化是表皮生长因子 (EGF) 与其细胞外结构域结合的反应。Thr669 是受体胞质结构域内的关键调控位点，位于两个脯氨酸残基 (-Pro-Leu-Thr669-Pro-) 附近。Thr669 处的磷酸化由细胞外信号调控激酶 (ERK) 介导，并作为一种负反馈机制，降低 EGFR 的酪氨酸激酶活性。这种调控通过抑制组成性酪氨酸磷酸化来防止过度信号传导，有助于控制受体活化并确保平衡的细胞反应。此外，Thr669 和其他位点（例如 Ser-1046/7）的磷酸化通过 ERK 和 p38 通路促进应激信号传导。

背景

表皮生长因子受体 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 是一种 170 kDa 跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶 (RTK) ErbB 家族的成员，该家族包括 EGFR、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4。这些受体触发细胞内信号通路，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt 通路，这些通路可调控细胞增殖、分化和凋亡。EGFR 在 Thr669 处的磷酸化是表皮生长因子 (EGF) 与其细胞外结构域结合的反应。Thr669 是受体胞质结构域内的关键调控位点，位于两个脯氨酸残基 (-Pro-Leu-Thr669-Pro-) 附近。Thr669 处的磷酸化由细胞外信号调控激酶 (ERK) 介导，并作为一种负反馈机制，降低 EGFR 的酪氨酸激酶活性。这种调控通过抑制组成性酪氨酸磷酸化来防止过度信号传导，有助于控制受体活化并确保平衡的细胞反应。此外，Thr669 和其他位点（例如 Ser-1046/7）的磷酸化通过 ERK 和 p38 通路促进应激信号传导。

参考文献
[1] Countaway JL, et al. J Biol Chem. 1989 Jun 25;264(18):10828-35. [2] Kawasaki Y, et al. Sci Rep. 2016 Aug 17;6:31502.

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