Phospho-EGF Receptor (Thr669) Rabbit mAb
目录号: F1394
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Lane 1: A-431
Lane 2: A-431 (EGF,100 ng/ml,15 min)
操作要点
WB
蛋白定位
细胞膜; 内质网; 胞内体; 高尔基体; 内膜; 细胞核; 细胞外环境
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 175 kDa |
| 阳性对照 | A-431 (EGF, 100 ng/ml, 15 min) |
|---|---|
| 阴性对照 |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting 样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 150mA 70min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
仅当 Thr669 磷酸化时 Phospho-EGF Receptor (Thr669) Rabbit mAb 才可检测内源性总 Phospho-EGF Receptor (Thr669) 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P00533 |
| 克隆号 |
|---|
| H18D23 |
| 背景 |
|---|
表皮生长因子受体 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 是一种 170 kDa 跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶 (RTK) ErbB 家族的成员，该家族包括 EGFR、ErbB2、ErbB3 和 ErbB4。这些受体触发细胞内信号通路，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt 通路，这些通路可调控细胞增殖、分化和凋亡。EGFR 在 Thr669 处的磷酸化是表皮生长因子 (EGF) 与其细胞外结构域结合的反应。Thr669 是受体胞质结构域内的关键调控位点，位于两个脯氨酸残基 (-Pro-Leu-Thr669-Pro-) 附近。Thr669 处的磷酸化由细胞外信号调控激酶 (ERK) 介导，并作为一种负反馈机制，降低 EGFR 的酪氨酸激酶活性。这种调控通过抑制组成性酪氨酸磷酸化来防止过度信号传导，有助于控制受体活化并确保平衡的细胞反应。此外，Thr669 和其他位点（例如 Ser-1046/7）的磷酸化通过 ERK 和 p38 通路促进应激信号传导。 |
| 参考文献 |
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