Phospho-eIF4B (Ser406) Rabbit mAb
目录号: F1305
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Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa(λ phosphatase-treated)
操作要点
WB
蛋白定位
胞质溶胶
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 80 kDa |
| 阳性对照 | Hela |
|---|---|
| 阴性对照 | Hela (λ-phosphatase) |
实验方法
| WB |
|---|
Western Blotting
样品制备
1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。
2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。
3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。
4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。
5. 离心5分钟(使用微量离心机)。
6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。
7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 200mA 120min)
膜封闭与抗体孵育
a. 封闭
1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。
2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。
3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
b. 抗体孵育
1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。
2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。
4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。
5. 进行检测。
显影检测
1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。
3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Phospho-eIF4B (Ser406) Rabbit mAb 仅当 Ser406 位点被磷酸化时才可检测内源性总 eIF4B 的蛋白水平。 |
| Uniprot ID |
|---|
| P23588 |
| 克隆号 |
|---|
| B22D6 |
| 背景 |
|---|
eIF4B 是一种 RNA 结合蛋白，也是进化上保守性最低的翻译起始因子。尽管序列保守性较低，但不同物种的 eIF4B 同源物具有相似的结构域结构，包括 N 端 RNA 识别基序 (RRM)、中心 DRYG 区域和 C 端富含精氨酸基序 (ARM) 结构域。eIF4B 在 eIF4 复合物中起辅助因子的作用，该复合物由 mRNA 帽结合蛋白 eIF4E、大型支架蛋白 eIF4G 和 RNA 解旋酶 eIF4A 组成。在 eIF4B 的帮助下，该复合物解开 mRNA 中的二级结构，促进核糖体着陆位点的形成。热休克和血清饥饿等环境压力会导致多个位点的 eIF4B 去磷酸化，这与翻译抑制同时发生。相反，胰岛素治疗后的 eIF4B 磷酸化与翻译增加有关。eIF4B 可以在体外可被多种激酶（包括 p70 S6 激酶）磷酸化。Ser406 位点的磷酸化（受 MAPK 和 PI3K/mTOR 信号通路调控）对于 eIF4B 的最佳翻译活性至关重要。这种特定的磷酸化对于 eIF4B 促进翻译的作用至关重要。 |
| 参考文献 |
|---|
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