Phospho-mTOR (Ser2448) Rabbit mAb
目录号: F0158
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All cells were serum starved
Lane 1: NIH/3T3
Lane 2: NIH/3T3 (insulin,150 nM,5 min)
Lane 3: NIH/3T3 (insulin in combination with λ-phosphatase)
操作要点
WB
蛋白定位
细胞质; 胞质囊泡; 内质网; 高尔基体; 溶酶体; 内膜; 微粒体; 线粒体; 线粒体外膜; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
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| WB, IP, IF |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 289 kDa |
| 阳性对照 | NIH/3T3 (insulin, 150 nM, 5 min); MCF-7 (insulin, 100nM, 10 min); HeLa (insulin, 150 nM, 6 min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Hela (insulin and λ-phosphatase treated); NIH/3T3 (insulin and λ-phosphatase treated) |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 | ||||
| NIH/3T3 | Insulin (150 nM, 5 min) | ||||
| MCF-7 | Insulin (100nM, 10 min) | ||||
| HeLa | Insulin (150 nM, 6 min) | ||||
| 点击查看更多样品数据 | |||||
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| IF |
|---|
实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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| WB |
|---|
实验步骤：
电泳分离
1.根据提取蛋白的浓度,加载适量蛋白样本和marker至SDS-PAGE胶上进行电泳；
2.电源调80V，30分钟。然后电源调（110V~150V），观察Marker，待蛋白所在的预染蛋白Marker指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流不要太大，电流太大（超过150mA）会导致温度上升，影响跑胶结果。如无法避免大电流，可以对电泳槽冰浴来降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化PVDF膜1分钟，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至PVDF膜上。（注意电转条件可以按照蛋白大小适当调节，电流大可以节省时间同时对分子量大的蛋白效果好，但需要保持电转槽在低温的环境中，避免胶的融化。）
封闭(可选)
1.电转移后,室温下用TBS洗膜5分钟；
2.在封闭液中孵育膜1小时,室温；
3.用TBST洗膜3次,每次5分钟。
抗体孵育
1.用5%的脱脂奶粉来配制一抗工作液（一抗稀释比1: 1000）,4°C条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2.用TBST洗膜3次,每次5分钟；
3.在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育1小时；
4.孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。
显色
1.加入配制好的ECL发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀；
2.与膜孵育1分钟,去除多余底物(保持膜湿润)，置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
Phospho-mTOR (Ser2448) Rabbit mAb可检测Phospho-mTOR (Ser2448)的内源性水平。 |
| 别名 |
|---|
| mTOR (phospho S2448),Phospho-mTOR (Ser2448),p-mTOR |
| Uniprot ID |
|---|
| P42345 |
| 克隆号 |
|---|
| H1M6 |
| 背景 |
|---|
哺乳动物雷帕霉素靶点 (mTOR) 是磷脂酰肌醇 3 (PI-3) 激酶相关激酶家族 (PIKK) 的成员，该家族包括 ATM、ATR、hSMG-1 和 DNA-PK。 这些大型 Ser/Thr 蛋白激酶在细胞对生长因子和应激的反应中发挥着重要作用。 尤其是，mTOR 在协调细胞生长与生长因子输入以及细胞营养和能量状态方面发挥着关键作用。 磷脂酰肌醇 3-激酶-AKT 途径主要参与有丝分裂信号向 mTOR 的传递。 其活性由 Akt 响应胰岛素或肌肉活动而磷酸化 Ser2448 来调节。 mTOR 中拟议的 AKT 磷酸化位点 (Ser-2448) 位于 C 末端调节区域内，删除该位点后，会导致体外和细胞内 mTOR 活性升高。 |
| 参考文献 |
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