Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Rabbit mAb
目录号: F0007
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客户使用Selleck的Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Rabbit mAb发表文献3篇
客户使用该产品的3个实验数据
操作要点
蛋白定位：细胞连接; 细胞质; 内膜; 细胞核; 细胞骨架。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议一抗稀释比 1:2000
Phospho-p44/42 MAPK 在部分细胞中本底表达低，建议先对其进行诱导刺激。
WB
建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
建议一抗稀释比 1:2000
Phospho-p44/42 MAPK 在部分细胞中本底表达低，建议先对其进行诱导刺激。
易错提示
Fig.1 细胞裂解液WB未看到条带 (细胞未经刺激)
本抗体识别Thr202/Tyr204 位点磷酸化的内源性 p44/42 MAPK (Erk1/2) 总蛋白水平，部分细胞系未经刺激处理时，该磷酸化蛋白表达水平较低，不能看到清晰条带。故建议制样过程中进行细胞刺激处理。
使用信息
| 稀释比例 |
|---|
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| 抗体应用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, F |
| 抗体类型 |
|---|
| Rabbit |
| 反应性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey, Mink, D. melanogaster, Zebrafish, Bovine, Dog, Pig, S. cerevisiae |
| 储存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 44, 42 kDa |
| 阳性对照 | Human urothelial carcinoma; Human squamous cell carcinoma; Human endometrioid adenocarcinoma; Human prostate adenocarcinoma; Human breast carcinoma; Human lung carcinoma; Human lung adenocarcinoma; 4T1 syngeneic tumor; Drosophila egg chambers; COS (TPA, 200nM, 10 min); HeLa (TPA, 400nM, 4h); 3T3 (TPA, 200 nM, 15 min); 293 (TPA-treated); NIH/3T3 (TPA-treated); C6 (TPA-treated); HT1080 (U0126, 10 uM, 2 h); Jurkat (TPA, 200nM, 30min) |
|---|---|
| 阴性对照 | Human lung carcinoma (λ phosphatase-treated); 293 (λ phosphatase-treated); NIH/3T3 (λ phosphatase-treated); C6 (λ phosphatase-treated) |
样品处理数据示例
| 样品 | 处理情况 | ||||
| COS | TPA (200nM, 10 min) | ||||
| Hela | TPA (400nM, 4 h) | ||||
| 3T3 | TPA (200 nM, 15 min) | ||||
| 点击查看更多样品数据 | |||||
*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org
实验方法
| WB |
|---|
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭（可选）
1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IF |
|---|
实验步骤：
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。
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| IHC |
|---|
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
|
生物描述
| 特异性 |
|---|
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Rabbit mAb 用于检测当Thr202/Tyr204 位点磷酸化时内源性 p44/42 MAPK (Erk1/2) 总的蛋白水平。 |
| 别名 |
|---|
| Phospho p44 MAPK (Thr 202), Phospho p42 MAPK (Thr 204), Phospho p44 ERK1 (Thr 202), Phospho p42 ERK2 (Tyr 204) |
| Uniprot ID |
|---|
| P27361, P28482 |
| 克隆号 |
|---|
| D13L13 |
| 背景 |
|---|
丝裂原激活蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinases, MAPK) 代表高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞过程。 其中，p44/42 MAPK (Erk1/2) 信号通路由多种细胞外信号触发，包括丝裂原、生长因子和细胞因子。 刺激后，启动连续的三步蛋白激酶级联，包括 MAP 激酶激酶激酶（MAPKKK 或 MAP3K）、MAP 激酶激酶（MAPKK 或 MAP2K）和 MAP 激酶 (MAPK)。 已鉴定出 p44/42 MAP3K 的不同成员，包括 Raf 家族成员、Mos 和 Tpl2/COT。 在此途径中，MEK1 和 MEK2 作为主要的 MAPKK，磷酸化 p44 和 p42，分别通过残基 Thr202/Tyr204 和 Thr185/Tyr187 激活它们。 |
| 参考文献 |
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技术支持
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