Phospho-PDGF Receptor β (Tyr 740) Rabbit mAb
目录号: F1500
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Lane 1: 3T3
Lane 2: 3T3 ( transfected with PDGF)
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB |
| 抗体类型 |
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| Rabbit |
| 反应性 |
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| Mouse |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
| 预测分子量 |
|---|
| 190 kDa |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含PMSF），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜）。 PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭（可选）
1. 电转移后，室温下用 TBS 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 5% 的脱脂奶粉来配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 65 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
当 Tyr 740 磷酸化时，Phospho-PDGF Receptor β (Tyr 740) Rabbit mAb 可检测内源性 Phospho PDGFRβ 总的蛋白水平。 |
| 克隆号 |
|---|
| M18D12 |
| 背景 |
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血小板衍生生长因子 (PDGF) 家族包含几种二硫键结合的二聚体亚型：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC 和 PDGF-DD。这些亚型以不同的模式特异性结合两种相关的受体酪氨酸激酶，即 PDGF 受体 α (PDGFRα) 和 PDGF 受体 β (PDGFRβ)。PDGFRα 同型二聚体与除含有 PDGF-D 的 PDGF 亚型之外的所有 PDGF 亚型相互作用，而 PDGFRβ 同型二聚体与 PDGF-BB、PDGF-DD 和 PDGF-AB 异二聚体结合。异二聚体 PDGF 受体 α/β 可识别 PDGF-B、PDGF-C 和 PDGF-D 同型二聚体以及 PDGF-AB 异二聚体。配体结合诱导受体二聚化和自身磷酸化，从而募集和激活含有 SH2 结构域的细胞质信号分子，例如 GRB2、Src、GAP、PI3K、PLCγ 和 NCK。这些激活的受体会启动各种信号级联，调控关键的细胞过程，包括细胞增殖、肌动蛋白细胞骨架重组、迁移和分化。值得注意的是，PDGFRβ 中的 Tyr740 对于其激活 PI3K 至关重要。 |
| 参考文献 |
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