Phospho-STAT1 (Ser 727) (C14E15) Rabbit mAb

目录号: F3253

    抗体应用: 反应性:
    规格 价格 库存 购买数量
    20uL 790 现货
    50uL 1240 现货
    100uL 1990 现货
    100uL*2 3790 现货
     

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    操作要点

    蛋白定位:细胞质, 细胞核
    WB
    建议使用 RIPA/NP-40 Lysis Buffer 制备裂解物。
    建议一抗稀释比 1:10000

    使用信息

    稀释比例
    1:1000
    1:100 - 1:250
    抗体应用
    WB, IHC
    反应性
    Human, Mouse, Rat
    抗体类型
    Rabbit
    储存液配方
    PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
    储存条件(自收到货起)
    -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
    预测分子量
    87 kDa

    实验方法

    WB
    实验步骤:
     
    样品制备
    1. 组织样品:破碎组织,加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),低温匀浆或置于冰上超声裂解样品,静置30 min。
    2. 贴壁细胞样品:吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),超声破碎,冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。
    3. 悬浮细胞样品:将培养基转移至离心管中离心,弃上清,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制剂Cocktail),冰上静置裂解 5 min。
    4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min,收集上清液;
    5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度;
    6. 加入蛋白上样缓冲液,将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min,冰上静置冷却后离心 5 min。
     
    电泳分离
    1. 根据所提蛋白的浓度,将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶(即下层胶)浓度:10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
    2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V,观察 Marker,待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后,即可停止电泳。(注意电泳时电流切勿过大,如超过 150 mA 会导致温度上升,容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流,可对电泳槽使用冰浴降温。)
     
    转膜
    1.拿出电转槽,把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中;
    2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用转移缓冲液冲洗;
    3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好;
    4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。(推荐采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔径规格选择参照表
    湿转法参考条件:200 mA, 120 min
    (注意电转条件可根据蛋白大小适当调节,分子量大的蛋白适宜采用大电流,并延长转膜时间,但需要确保电转槽始终处于低温的环境中,避免凝胶融化。)
     
    封闭
    1. 电转移后,室温下用 TBST 洗膜 5 min;
    2. 在封闭液中将膜孵育 1 h,室温;
    3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    抗体孵育
    1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液(建议一抗稀释比 1:10000),4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜;
    2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
    3. 在封闭液中加入二抗,室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h;
    4. 孵育结束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
     
    显色
    1. 加入配制好的 ECL 发光底物(或根据二抗选择其他显色基质)混合均匀;
    2. 与膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜湿润),置于显影仪中进行曝光。
     

    Datasheet & SDS

    生物描述

    特异性
    Phospho-STAT1 (Ser 727) Rabbit mAb 用于检测当 Ser 727 位点磷酸化时内源性 Phospho-STAT1 (Ser 727) 总的蛋白水平。
    别名
    Phospho-Stat1 (Ser727),STAT1 (phospho S727)
    克隆号
    C14E15
    背景
    磷酸化STAT1 (Ser727) 指的是STAT1蛋白在丝氨酸727位置的磷酸化,STAT1是一个关键的转录因子,参与细胞对应激因子(如紫外线辐射、LPS、TNF-α)和细胞因子信号(如IFN-γ)的反应。STAT1是信号转导与转录激活因子(STAT)家族的一员,包含一个N端结构域、DNA结合域、SH2结构域(用于二聚化)以及C端转激活结构域(TAD),Ser727位于此结构域内。由应激激活的激酶(如p38 MAPK、ERKs或PI-3K/Akt)介导的Ser727磷酸化,通过招募共激活因子(如CBP/p300)和染色质修饰因子增强转录活性,这与Tyr701磷酸化(经典的JAK依赖通路)不同。该修饰对于整合应激和免疫信号至关重要,能够增强巨噬细胞的抗微生物反应,并激活与凋亡、细胞存活和免疫记忆相关的基因。在紫外线B照射下,Ser727的磷酸化增加STAT1的DNA结合亲和力,推动应激反应基因网络的激活;而在IFN-γ信号传导中,它与Tyr701磷酸化协同作用,最大化靶基因的表达。刺激撤除后(如IFN-γ),持续的Ser727磷酸化可能通过与染色质相关的激酶(如CDK8)保持转录记忆。该过程的失调可通过调节肿瘤抑制基因和促炎介质(如iNOS)导致炎症、免疫逃逸及癌症发生。
    参考文献

    技术支持

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