Phospho-Stat3 (Tyr705) Rabbit mAb

目录号: F0157

Filter:

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (IFNα,100 ng/mL,5 min)
Lane 3: HeLa
Lane 4: HeLa (IFNγ,100 ng/mL,30 min)
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F0157 at 1/100 dilution.

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
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100uL*2	3790	现货
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操作要点

WB
蛋白定位
细胞质; 细胞核
建议使用 RIPA/NP-40 裂解。

使用信息

稀释比例
WB1:1000 IP1:100 IHC1:100-1:400 IF1:100-1:200 FCM1:100-1:400

抗体应用
WB, IP, IHC, IF, FCM, ChIP

抗体类型
Rabbit

反应性
Human, Mouse, Rat, Monkey

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
88 kDa

阳性对照	Human prostate adenocarcinoma; Mouse intestine; Human lung carcinoma; Human breast carcinoma; Jurkat (IFNα-treated); A431 (IFNα-treated); HeLa (IFNα, 100 ng/mL, 5 min); U266 (hIFN-α, 50 ng/ml, 15 min); Hep G2 (IL-6, 100 ng/ml, 30 min)
阴性对照

样品处理数据示例

样品	处理情况
Jurkat	IFNα treatment
A431	IFNα treatment
HeLa	IFN-α (100 ng/mL, 5 min)
U266	IFN-α (50 ng/mL, 15 min)
HepG2	IL-6 (100 ng/mL, 30 min)
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^*该蛋白在不同的人源细胞、组织内的表达量预测请参考：http://www.proteinatlas.org

样品	处理情况

实验方法

WB
Western Blotting 样品制备 1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。 2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。 3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。 4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。 5. 离心5分钟(使用微量离心机)。 6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。 7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 200mA 120min) 膜封闭与抗体孵育 a. 封闭 1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。 2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。 3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 b. 抗体孵育 1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。 2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。 4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。 5. 进行检测。显影检测 1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。 2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。 3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

Western Blotting

样品制备

1. 吸去培养基,用1X PBS清洗细胞。

2. 加入1X SDS上样缓冲液裂解细胞,将提取物转移至微量离心管中。置于冰上。

3. 超声10–15秒,完成细胞裂解和DNA剪切。

4. 将20 µl样品在95–100°C加热5分钟,然后置于冰上冷却。

5. 离心5分钟(使用微量离心机)。

6. 将适量样品上样至SDS-PAGE凝胶(上样量取决于提取蛋白浓度)。注意:同时请上样预染分子量标准,以确定分子量并验证电转效果。

7. 电转至硝酸纤维素膜/PVDF膜。(湿转法参考条件: 200mA 120min)

膜封闭与抗体孵育

a. 封闭

1. (可选)转膜完成后,用TBS室温洗膜5分钟。

2. 将膜在封闭液中室温孵育1小时。

3. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

b. 抗体孵育

1. 将膜与一抗(按推荐的稀释度和稀释液配制)置于一抗稀释缓冲液中,4°C温和摇床过夜孵育。

2. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

3. 将膜与适当的二抗(稀释于封闭液中)在室温下温和摇床孵育1小时。

4. 用TBST洗涤3次,每次5分钟。

5. 进行检测。

显影检测

1. 抗体孵育结束后,用TBST洗膜3次,每次5分钟。

2. 配制ECL发光试剂(或根据二抗类型选择其他显色剂/底物)。混匀。

3. 将底物与膜孵育1分钟,去除多余溶液(膜保持湿润),置于显影仪中进行曝光。

IHC
实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IHC

实验步骤：

脱蜡/补液

1. 脱蜡/水合切片：

2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。

3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。

4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。

5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。

2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。

5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。

6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。

7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。

9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。

10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。

11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。

12. 将载玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用苏木精复染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。

16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

IF
实验步骤：标本制备 1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。 2. 室温固定细胞 15 分钟。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 继续进行免疫染色。免疫染色 1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。 2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。 3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。 4. 4°C 孵育过夜。 5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。 7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。 8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。 9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

实验步骤：

标本制备

1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。

2. 室温固定细胞 15 分钟。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

4. 继续进行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。

2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。

3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。

4. 4°C 孵育过夜。

5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。

7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。

9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。如需长期保存，请将载玻片平放在 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
仅当 Tyr705 位点发生磷酸化时，Phospho-Stat3 (Tyr705) Rabbit mAb 才可检测内源性总 Phospho-Stat3 (Tyr705) 的蛋白水平。

别名
Phospho-Stat3 (Tyr705),p-Stat3,STAT3 (phospho Y705)

Uniprot ID
P40763

克隆号
B17F7

背景
STAT3 是一种转录因子和细胞内信号蛋白，由一系列细胞因子、生长因子和细胞内激酶激活。它是各种身体系统发育和功能的基础，对生命至关重要。在免疫系统中，STAT3 对免疫细胞（尤其是 T 细胞和 B 细胞）的成熟至关重要。磷酸化-Stat3 (Tyr705) 是 STAT3 激活的关键标志物，对其在转录调控和细胞过程中的功能至关重要。Tyr705 处的磷酸化促进 STAT3 二聚化、核易位、与特定 DNA 反应元件结合以及激活与细胞存活、增殖和肿瘤进展有关的基因。在乳腺癌中，尤其是在三阴性乳腺癌 (TNBC) 中，经常观察到 pTyr705-STAT3 水平升高。

背景

STAT3 是一种转录因子和细胞内信号蛋白，由一系列细胞因子、生长因子和细胞内激酶激活。它是各种身体系统发育和功能的基础，对生命至关重要。在免疫系统中，STAT3 对免疫细胞（尤其是 T 细胞和 B 细胞）的成熟至关重要。磷酸化-Stat3 (Tyr705) 是 STAT3 激活的关键标志物，对其在转录调控和细胞过程中的功能至关重要。Tyr705 处的磷酸化促进 STAT3 二聚化、核易位、与特定 DNA 反应元件结合以及激活与细胞存活、增殖和肿瘤进展有关的基因。在乳腺癌中，尤其是在三阴性乳腺癌 (TNBC) 中，经常观察到 pTyr705-STAT3 水平升高。

参考文献
[1] Stenckova M, et al. Pathol Oncol Res. 2022 Aug 9;28:1610592.

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